10 种特级酱油香气差异分析

史伊格，蒲丹丹，勇倩倩，黄实宽，陈洪卫，张玉玉,*

（1.中原食品实验室，北京工商大学，北京 100048；2.中国商业联合会味科学重点实验室，北京工商大学，北京 100048；3.烟台欣和企业食品有限公司，山东烟台 264006）

酱油是以大豆和/或脱脂大豆、小麦和/或小麦粉和/或麦麸等为主要原材料，经过微生物发酵制成的液体调味品[1]，在我国已有3000 多年的历史。酱油的香气已经被研究了100 多年，检测出1000 多种芳香化合物，包括醇类、醛类、酯类、酸类、吡嗪类、呋喃类、酮类、酚类、烷烃类等化合物，为酱油贡献醇香、麦芽、焦糖、烟熏、花和水果等香气[2]。氨基酸态氮是酱油发酵过程中的主要产物，是酱油鲜味的主要来源，也是衡量酱油品质的重要标准。国标规定，特级酱油可溶性无盐固形物≥15 g/100 mL，全氮≥1.5 g/100 mL，氨基酸态氮含量≥0.8 g/100 mL[3]。作为调味品，酱油香气的好坏是衡量其质量的重要指标，同样也是影响消费者是否购买的关键要素。特级酱油具有浓郁的酱香，鲜美醇厚，深受消费者喜爱。但各地消费者的生活习惯和对食品的口味要求不同，酱油也相应具有一定的地域性。明确特级酱油的风味组成、特级酱油之间的风味差异以及特级酱油与其他酱油的风味差异，有利于特级酱油风味品质的控制以及从香气感知角度建立品质区分模型。然而对于特级酱油间的风味差异分析还较少，所以明确特级酱油间的香气特征差异是当前急需解决的行业问题。

目前，气相色谱-串联质谱（Gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）是检测酱油中的芳香化合物的常用检测方法。液液萃取结合溶剂辅助风味成分蒸发（Solvent assistant flavor evaporation，SAFE）萃取是常用的挥发性成分分离富集方法，该方法制备的芳香提取物具有更为自然的香气特征，Wang等[4]采用SAFE 萃取法在酱油中共检测出55 种FD 因子＞8 的关键气味活性化合物。然而，SAFE 耗时费力，并且使用大量有毒有机溶剂[5]。还可以采用其他提取方法，如搅拌棒吸附萃取（Stir bar sorptive extraction，SBSE）[6]、同时蒸馏萃取（Simultaneous distillation extraction，SDE）[7]、固相微萃取（Solidphase microextraction，SPME）和固相萃取（Solidphase extraction，SPE）等。在酱油中，SBSE 捕获了更多较难挥发的化合物，包括乙酸苯乙酯和肉桂酸乙酯等[6]。Feng 等[7]采用SDE 方法检测到酱油中26 种香气活性化合物。SPME 是近年来提出的所有技术中最流行的。该方法不需要有机溶剂，速度快，操作简单，成本低。SPE 可以将样品提取、浓缩和纯化集成在一个SPE 筒中，具有操作简单、溶剂消耗少、易于标准化和重复性良好等优点，可以分离鉴定出更多的酯、醇和高沸点化合物[7]，对酸的干扰也更少[8]。

当前市场酱油种类丰富多样，不同品牌间感官品质差异明显，通过研究不同酱油间的风味差异有利于从分子角度阐明其关键呈香物质及其对香气特征的贡献，为酱油品质控制和品质提升提供科学依据。因此，本文选取10 种不同品牌的高盐稀态发酵特级酱油作为样品，结合SPME 和SPE 两种萃取方法提取酱油中香气化合物，并通过GC-MS 对特级酱油香气化合物进行鉴定。通过对挥发性香气物质定量分析和香气化合物的香气活性值（Odor activity values，OAV）计算，对比不同香气化合物对酱油香气的贡献，随后进一步对香气活性化合物进行偏最小二乘回归分析（Partial least squares regression，PLSR），确定特级酱油香气化合物与香气属性的相关性，明确不同酱油之间的差异组分及其贡献，旨在为特级酱油生产过程中香气的调控及产品工艺改进提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

特级酱油 北方市场销售量较高的10 种，均购买于网上商城。10 种酱油的简称、品牌信息以及主要原料和配料如表1 所示；二氯甲烷（99.9%）、甲醇（99.9%）色谱级，默克化学公司（中国上海）；2-甲基-3-庚酮（99%）、5-乙基-4-羟基-2-甲基-3（2H）呋喃酮（≥98%）分析级，麦克林生化公司（中国上海）；2,5-二甲基-4-羟基-3（2H）-呋喃酮（≥98%）分析级，Sigma-Aldrich（德国斯坦海姆）；乙酸乙酯（分析级）、4-乙基-2-甲氧基苯酚、C6～C28 正链烷烃混合物标准（≥97%）色谱级，Sigma（中国，上海）；无水硫酸钠（99.9%）分析级，国药集团化学试剂有限公司（中国北京）；54 种香气轮廓 法国Le Nez duVin®；高纯氦气（99.999%）北京双泉天缘工业气体有限公司。

表1 10 种特级酱油品牌信息及其原理和配料Table 1 Information on 10 brands of extra soy sauce and their principles and ingredients

8890 GC-5977B GC/MSD 气相色谱-质谱联用仪配置三合一自动进样器、固相微萃取萃取头（85 μm CRA/PDMS）、LiChrolut EN 固相萃取小柱 安捷伦科技有限公司；T-403 电子分析天平 北京天林恒泰科技有限公司；EYELAN-1100 旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社；BF2000 氮吹仪 北京八方世纪科技有限公司；CYLDZ-6 分液漏斗立式摇床 北京国环高科自动化技术研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 顶空固相微萃取（HS-SPME）香气成分萃取将4 mL 酱油样品移入20 mL SPME 专用样品瓶，加入0.70 g NaCl。样品在45 ℃水浴中加热平衡20 min。随后在相同温度下采用萃取头进行顶空萃取40 min。萃取头使用前250 ℃ 解析10 min，采用脉冲不分流模 式[9]。添加10 μL 2-甲基-3-庚酮（0.10 mg/mL，溶剂为甲醇）。所有样品重复三次。

1.2.2 固相萃取（SPE）香气成分萃取 取30 mL 酱油以1:1.5 比例用45 mL 二氯甲烷进行液液萃取。加入30 µL 混合内标（2-辛醇，5.00 mg/mL；1,2-二氯苯，5.40 mg/mL；2-甲基-3-庚酮，4.60 mg/mL；2-十一烷酮，4.00 mg/mL）于分液漏斗内，以290 次/min 的速率萃取10 min。重复以上步骤2 次。加入无水硫酸钠于-18℃冷冻过夜除水。25 ℃ 旋蒸浓缩至约3～5 mL，然后先将SPE 小柱分别用10 mL 甲醇和去离子水活化。将浓缩提取物以2 mL/min 的速度通过LiChrolut EN 小柱，3 mL 二氯甲烷洗脱样品[10]。随后，将洗脱下的液体过0.22 µm 有机滤膜到分析瓶中，氮吹浓缩至1 mL。最后，对浓缩提取物进行挥发性成分分析。所有样品重复三次。

1.2.3 感官评价 从实验室招募了8 名无鼻炎、嗅觉正常的感官评价小组成员，评价人员都有一定的感官评价经验，且熟悉定量描述性感官评价方法（Quantitative discriptive analysis，QDA）。首先让评价人员熟悉并识别54 种香气轮廓（Le Nez duVin®），随后通过对随机呈递的不同香气特征样品进行评价训练，能够正确识别随机样品香气特征的评价人员进行酱油样品评价环节[10]。通过感官描述词的频率统计结果和评价小组讨论，确定酱油的7 种香气特征：酱香、焦糖香、烟熏香、烤土豆香、麦芽香、醇香、酸香。在25 ℃条件下，将10 种特级酱油装在无味的透明塑料瓶中（10 mL），并对塑料瓶随机编码3 位数字。要求评价人员将7 个给定香气轮廓进行强度打分（1～3，微弱；4～6，中等；7～9，较强）。

1.2.4 GC-MS 分析条件

1.2.4.1 GC 条件 色谱柱：DB-WAX 石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；升温程序：起始温度为35 ℃保持1 min，以4 ℃/min 速率上升到100 ℃后保持1 min；2 ℃/min 速率上升至170 ℃后保持1 min；5 ℃/min 速率上升至220 ℃后，保持1 min；载气（He，99.999%）流速1.00 mL/min，压力2.4 kPa，SPME 采取脉冲不分流，SPE 分流比为20:1，进样量1 µL。

1.2.4.2 MS 条件 质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度250 ℃；质量扫描范围m/z 35～550；扫描模式为全扫描；调谐文件为标准调谐。

1.2.4.3 定性定量分析 定性定量方法：GC-MS 数据比对NIST 20 数据库进行检索。化合物的定性采用比较MS 数据库、保留指数（Retention index，RI）、标准品。RI 计算公式如下，在相同的色谱条件下，以正构烷烃（C6～C28）的保留时间为标准，计算各化合物的RI 值。

式中：t（x）为化合物x 的保留时间；n 为化合物x 保留时间前出峰的正构烷烃碳原子个数；t（i）和t（i+1）分别为具有i 和i+1 个碳原子的正构烷烃的保留时间。

定量分析：SPME 分析的样品以2-甲基-3-庚酮为内标，SPE 分析的样品通过混合内标分析，通过色谱峰面积比较，计算出未知香气活性化合物的含量[11]。

OAV 计算方法：挥发性香气物质的含量与其水中阈值的比值[9,12-13]，其中OAV≥1 的物质被认为是能够被人感知的香气活性化合物，对样品的香气感知有重要贡献，且OAV 值越高贡献越大。

1.3 数据处理

采用 Microsoft Excel 2021 统计香气化合物和香气轮廓，采用Origin Pro 2021（OriginLab Corporation，美国）制图得到 QDA 曲线。香气物质与香气轮廓的相关性分析采用XLstat 2018（Addinsoft，纽约，美国）进行偏最小二乘分析（PLSR），其中X 变量为香气物质（OAV≥1），Y 变量为香气轮廓的强度。显著性分析（P＜ 0.05）采用SPSS 17.0 软件分析（Duncan test）。

2 结果与分析

2.1 10 种特级酱油感官评价结果

招募的8 名感官评价人员能够区分54 种香气特征，并且对随机取出的香气成分能够准确地描述其香气特征和与之相关的食品。在预实验中对随机编号样品打分的感官评价数据标准偏差在20%以内，符合感官评价人员的筛选标准[13]。QDA 分析结果如图1 所示，在所有样品中酱香的香气强度最大，其次是烟熏香、酸香、醇香、焦糖香和麦芽香，烤香整体强度最弱。XH1 酱油的酱香和醇香的强度最强；XH2 酱油的麦芽香气最强；WZ 酱油的焦甜香和烟熏香最强，且醇香强度与XH1 一致；LJJ1 酱油的酸香最强；QH 酱油的烤香最强，麦芽香和醇香最弱；CB 酱油的酱香和焦糖香最弱；LJJ2 酱油的烟熏香最弱；LH 的烤香最弱；XH2 和HT2 酱油的酸香最弱。

图1 10 种特级酱油感官评价结果Fig.1 Sensory evaluation results of 10 brands of premium soy sauce

2.2 10 种特级酱油挥发性香气物质分析

10 种酱油共检测86 种挥发性香气化合物，各物质含量测定结果如表2 所示。CB 酱油中吡嗪类物质含量最高，为182.796 μg/L，其中2,6-二甲基吡嗪为66.256 μg/L。该结果与感官评价结果一致，即CB 酱油的烤香最强。吡嗪类化合物在发酵过程中通过缓慢的美拉德反应和加热灭菌过程中产生，其浓度受许多因素影响，如发酵温度和灭菌条件等[14]。此外，吡嗪化合物是酵母提取物中的重要气味成分[15-17]，10 种酱油配料中均添加了酵母抽提物，因此，酱油样品中的吡嗪化合物也可能来源于原料中的酵母提取物。添加酵母抽提物可以改善酱油的风味[18-20]，在酱油发酵前期添加可增强酱油的麦芽、焦糖和花果香气；中、后期添加酵母抽提物，酯类、醛类和醇类等物质浓度下降[21]；直接添加到成品酱油中，可在增强酱油增鲜的同时去除酱油中的豆腥味[22]。

XH1 酱油中乙酸（28657.455 μg/L）含量最高。酱油中的酸味主要由乙酸引起，来源于乳酸菌发酵[15]。其酚类物含量最高（47356.009 μg/L），其中4-乙基-2-甲氧基苯酚（18240.479 μg/L）含量为所有样品中最高。酚类化合物是由曲（发酵剂）在发酵过程中产生的羟基肉桂酸和羟基苯甲酸形成[23]。WZ 酱油的酚类化合物种类最多，该结果与感官评价结果对应，即WZ 和XH1 酱油的烟熏香强度最高。酮类化合物主要来源于美拉德反应，其中LH 酱油的酮类化合物含量最高（19135.535 μg/L），与其具有最强的焦甜香一致。

除了酚类化合物，XH1 酱油中酯类化合物（13986.445 μg/L）含量也较高，乙酸乙酯含量为199.011 μg/L。酯类化合物通常由醇和酸的酯化反应产生。酯类与酵母代谢脂质同样有关，主要在发酵的中间阶段积累[24]。高分子量脂肪酸酯也存在于酱油中，由长链脂肪酸在真菌脂肪酶存在下经过长时间恒温发酵后生成[25]。

XH1 酱油醇类化合物含量最高（146664.28 μg/L），显著高于其他样品，且与感官评价中醇香强度最强结果一致。CB 酱油中醇含量最少为33305.645 μg/L，该差异源于不同发酵方法及原料差异[26]。LH 酱油异丁醇（51.223 μg/L）和2,3-丁二醇（57921.798 μg/L）含量在所检测样品中均为最高。在好氧条件下的发酵阶段，杂醇主要可以由糖和支链或芳香族氨基酸产生[27]。乙醇是酱油发酵过程中葡萄糖与氨基酸通过Ehrlich 途径与α-酮酸脱羧等多种途径生成[28]。2/3-甲基丁醛是贡献麦芽香的关键成分[11-12]，其中XH2酱油中的3-甲基丁醛含量最高（4.012 μg/L），该结果与感官评价结果一致，即XH2 酱油的麦芽香气最强。CB 酱油中香气化合物种类最少共检测到62种，XH1 酱油中的香气化合物种类最多为75 种，该结果与感官评价结果一致，CB 酱油的整体香气轮廓强度较弱。

2.3 PLSR 分析结果与感官评价结果

化学计量学可将食品的感官品质、物理化学性质、工艺参数与风味物成分和含量等参数进行关联分析，为感官科学和风味分析的融合发展起到了重要的作用[29-30]。采用偏最小二乘分析（PLSR）不同特级酱油中的香气物质与香气轮廓之间的相关性，结果如图2 所示。PLSR 分析的结果显示第一主成分（Dim 1）的解释变量为38.4%，预测变量为20.2%；第二主成分（Dim 2）的解释变量为56.4%，预测变量为38.8%，说明了该 PLS 预测模型的可靠性。

图2 10 种特级酱油香气物质与香气轮廓的偏最小二乘相关性模型分析Fig.2 Correlation matrix of the aroma compounds to the aroma attributes among 10 brands of premium soy sauces

由图2 可知，PLSR 分析分将 10 种不同的特级酱油样品分成了三组，CB 酱油为一组，LJJ1 酱油、QH 酱油、HT1 酱油、LH 酱油、XH2 酱油、LJJ2 酱油、WZ 酱油和HT2 酱油为一组；XH1 酱油为一组。PLSR 结果表明，CB 酱油与其他酱油有较大区分，这与GC-MS 结果相同。根据PLSR 结果显示，共有15 个香气物质的 VIP 值在三个主成分中均大于0.7，说明它们与特级酱油中酱香、醇香、酸香、烟熏香、焦糖香、烤香和麦芽香显著相关（P＜0.05）。根据化合物与感官属性的相关系数结果（图3）可知，3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、壬醛、糠醇、苯甲醛、4-乙基-2-甲氧基苯酚、4-乙基苯酚等物质与酱香呈显著（P＜0.05）正相关；壬醛、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和2,3-丁二醇等与烟熏香呈显著（P＜0.05）正相关；3-羟基-2-丁酮、甲基麦芽酚和4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮等与焦糖香呈显著（P＜0.05）正相关；3-羟基-2-丁酮、乙酸乙酯和苯甲醛等化合物与麦芽香呈显著（P＜0.05）正相关。

图3 10 种特级酱油中15 种香气活性化合物与香气属性的相关系数热图Fig.3 Heat map of correlation coefficients of 15 aroma-active compounds to the aroma attributes

2.4 10 种特级酱油香气物质的香气活性值分析

挥发性香气化合物对酱油的贡献可以通过OAV 进行评价。为了进一步评估挥发性香气化合物对酱油整体香气的贡献，对其OAV 进行计算，结果见表3。从10 中特级酱油中共发现30 种OAV≥1的挥发性香气化合物，包括乙酸乙酯、5-乙基-4-羟基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮、二甲基三硫、愈创木酚等。吡嗪类化合物多具有烤香及可可香，其中3-乙基-2,5-甲基吡嗪OAV 最大（OAV=0～20），XH1 酱油最高。焦糖香是构成酱油整体风味的关键[2,6]。5-乙基-4-羟基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮赋予酱油强烈的甜香、焦糖、面包香气，其OAV 为373～4698。HT1 酱油中5-乙基-4-羟基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮OAV 最高。除了呋喃类化合物，甲基麦芽酚（2～18）也会产生焦糖样香气，甲基麦芽酚由糖在加热过程中通过2,3-烯醇化或直接由Amadori 重排形成，存在于蒸熟大豆中[31]。WZ 酱油中甲基麦芽酚OAV 最高，赋予其较强烈的焦糖香。3-甲基丁醛（0～4）具有麦芽香，XH2 中3-甲基丁醛OAV 最高，这与感官评价结果相同。愈创木酚（2～22）具有典型的烟熏香气[7]，4-乙基愈创木酚（3～204）和4-乙基苯酚（0～2）同样具有烟熏香，它们的OAV 均大于1。在其他实验中，添加了酵母抽提物的酱油样品4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-乙基苯酚含量高于不添加酵母抽提物的样品[27]。3-甲硫基丙醛（0～10）具有熟土豆香气，尽管其以低浓度存在，但它正鼻气味阈值很低，OAV 较大[32]，这与之前的实验结果相同[4]。HT1 酱油中3-甲硫基丙醛OAV 最大。3-甲硫基丙醛在Strecker 降解和发酵过程中产生[33]，在热灭菌或烹饪过程中也会大量产生，这会增加熟土豆类气味的强度[34]，3-甲硫基丙醇同样有助于酱油中熟土豆的香气[12]。其他含硫化合物，包括二甲基三硫（0～226）具有熟洋葱香气，也具有较高OAV。酯类化合物通常具有果香，果香和花香使酱油香气更加饱满和谐[35-36]。其中乙酸乙酯（1～2）是酱油中典型的果香化合物[37-40]。1-辛烯-3-醇具有蘑菇的香气，是米曲霉孢子的特征性挥发性成分。酱油的发酵过程中采用了米曲霉作为主要的发酵菌种，可以推测1-辛烯-3-醇可能主要来源于大曲发酵阶段[39]。

表3 10 种特级酱油样品中风味物质的香气活性值Table 3 Aroma activity values of aroma-active compounds in 10 brands of premium soy sauces

结合PLSR 分析与OAV 分析发现，乙酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮、4-乙基愈创木酚和4-乙基苯酚是造成不同品牌特级酱油香气轮廓差异的关键香气成分。而3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、二甲基三硫、5-乙基-4-羟基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮和愈创木酚是对不同品牌特级酱油香气轮廓均具有重要贡献的共性成分。

3 结论

感官评价结果显示，特级酱油具有较为强烈的酱香、烟熏香和酸香，其中WZ 和XH1 酱油的酱香、焦糖、烟熏、醇香最强，LJJ1 的酸香最强、XH2酱油的麦芽香最强，QH 和HT1 酱油的烤香最强，该结果与香气化合物的种类和含量具有相关性。10 种特级酱油中共鉴定出86 种挥发性化合物，CB 酱油中吡嗪类物质含量最高，其中2,6-二甲基吡嗪为66.256 μg/L。XH1 酱油中酚类物含量最高，其中4-乙基-2-甲氧基苯酚为18240.479 μg/L。除了酚类化合物，XH1 酱油同样含有较高浓度的酯类化合物，乙酸乙酯含量为199.011 μg/L。XH2 酱油具有最高的3-甲基丁醛（4.012 μg/L），呈现较强的麦芽香气。LH 酱油中异丁醇（51.223 μg/L）和2,3-丁二醇（57921.798 μg/L）含量在所检测样品中均为最高。WZ 酱油的酚类化合物种类最多，与其烟熏香强度最高一致。XH1 乙醇含量最高，为147.257 μg/L。香气活性值计算结果显示，共30 种香气活性成分（OAV≥1）对特级酱油的香气贡献较大，其中14 种为10 种酱油中共有成分，如乙酸乙酯、5-乙基-4-羟基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮等。结合OAV 分析和PLSR 回归分析，乙酸乙酯、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮、4-乙基愈创木酚和4-乙基苯酚是造成不同品牌特级酱油香气轮廓差异的关键香气成分。