基于高产胞外粗多糖的白灵芝发酵茶培养基配方优化

卯明娟，刘 迪，周会明,*，白玉英，洪 鹏，王佳琳，杨流波，陈真敏

（1.滇西科技师范学院生物技术与工程学院，云南临沧 677000；2.延边大学农学院，吉林延吉 133002）

白灵芝（Ganoderma leucocontextum）又称为藏灵芝、白肉灵芝或藏白灵芝，作为一种常见的中药材，其生长于高海拔地区，是灵芝属少有且具有重要经济价值的低温型灵芝种质资源[1-3]。该菇菌肉洁白，菇体富含多糖类物质[4]、三萜类化合物[5]、粗蛋白质等活性成分[6-7]，其中，多糖类物质是白灵芝最主要的活性成分[8]且含量高于其他普通灵芝品种[9]，具有抗氧化应激[10]、增强免疫力[11]、延缓衰老[12]等多种生物活性和药理作用，为该菇在治疗多种疾病方面提供了一定的理论基础，也已成为保健食品研发的重要资源[13-14]，被称为高品质的种类，售价高于普通灵芝数倍，市场开发前景好[7,15]。

胞外粗多糖是大型真菌细胞分泌到胞外的多糖物质，参与了多种生理和病理过程，其生物合成过程涉及多种酶催化反应，各种酶的表达和活性受到多种内外因素的调节，如菌株遗传特性[16]、营养条件[17]、非营养条件[18]等因素影响下菇体胞外多糖的产量存在明显的差异，白灵芝也不例外。据胡惠萍等[15]报道，西藏林芝地区的两株白灵芝菌株其多糖含量差异较大，同时，刘艳芳等[14]对该菇子实体与菌丝体中多糖含量进行了测定，结果显示，白灵芝液体发酵后菌丝体中的多糖含量明显高于人工栽培子实体，但关于营养因素与非营养因素对该菇胞外粗多糖的影响未见报道。白灵芝作为多糖类活性成分丰富且稀有的药用种质资源，因该菇基础研究系统性不足、人工培养历史短、栽培技术不完善、优良菌种选育滞后、产品开发技术落后等导致其市场供应受限[19-20]，功能性成分有待深入研究。液体发酵技术可提供大型真菌适宜的营养条件，具有生产周期短、成本低、产量高等优点[21]，能在短时间内生产大量的胞外粗多糖[22]。因此，通过液体发酵技术的手段提高白灵芝胞外粗多糖的产量对推进该菇的开发利用进程具有重要意义。

茶叶是世界公认的健康饮品且具有多重保健功效[23]，对灵芝多糖的形成有显著的促进作用[24]。马铃薯营养丰富、全面，葡萄糖容易被菌丝体吸收，均能为大型真菌液体发酵提供充足的碳源和能量[25-26]。红土是茶树生长适宜的土壤类型之一，其浸出液有利于提高菇类的菌丝生物量[27]。

本研究结合当地的低档茶叶资源，采用液体发酵技术，在马铃薯红土葡萄糖培养基的基础上，以其胞外粗多糖产量为考察指标，探究了基础培养基各组分的浓度、茶叶的种类及其颗粒大小对白灵芝液体培养特性与胞外粗多糖分泌的影响。同时，采用正交试验、方差分析、相关性分析等方法明确白灵芝高产胞外粗多糖的最佳营养条件及其影响因素，以期为该菇多糖的提取、功能性产品的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白灵芝（Ganoderma leucocontextum）菌种由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供；绿茶、白茶、红茶 均购于云南省临沧市双江县邦丙乡茶农；普洱茶 购于云南省西双版纳州勐海县茶农；马铃薯 购于临沧市临翔区老祥云；红土 采集于滇西科技师范学院校园绿化林；琼脂、葡萄糖 均为分析纯，北京奥博生物技术有限公司。

LS-75HG 型立式压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备有限公司；PB-21PH 酸度计 德国赛多利斯公司；TS-2102 恒温摇床 上海天呈实验仪器制造有限公司；TDL-4 台式离心机 上海安亭科学仪器厂；RE-52 系列旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；TD-35 数字折光仪 浙江托普仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化、接种及培养 将常温活化的白灵芝菌种转接至PDA 平板培养基内，27 ℃下恒温培养5～7 d[28]。待菌丝长满培养基平板后，用孔径为0.5 cm 的打孔器对菌落均匀打孔，取同心圆3 个菌块接于各液体培养基内，在27 ℃、遮光、121 r/min的恒温摇床内培养15 d，记录菌丝萌发与菌球形成时间（d）[29]。

1.2.2 单因素实验 基于发酵基础培养基（马铃薯200 g，红土3 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 L，pH 自然）分别制作马铃薯（100、200、300 g/L）、葡萄糖（0、10、20、30 g/L）、红土（0、1、2、3 g/L）、茶叶（0、16、20、24 g/L）各单因素液体培养基，其中马铃薯洗净切成1 cm3的小方块，煮至玻璃棒戳后散开，经层纱布过滤，取马铃薯汁；红土研磨后经200 目网筛处理，粉末煮10 min 后8 层纱布过滤，取滤液；有关采用液体发酵法测定食用菌在茶叶基质上其胞外粗多糖产量的研究仅在绿茶上有所报道[24]，故本研究以绿茶为代表开展茶叶添加量筛选试验，试验采用无糖培养基，茶叶在500 mL 自来水中煮沸10 min，取茶汤，同时，以上述质量浓度为20 g/L 的绿茶配方对照，茶叶处理方式由茶汤变为茶粉，干茶叶粉碎后过200 目网筛（孔径0.075 mm），取茶粉。上述培养液分装于三角瓶（100 mL/250 mL）内，每处理3 次重复，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，冷却后趁热（30 ℃左右）接菌。

1.2.3 正交试验 根据单因素实验结果，明确正交试验的因素数值范围，在茶叶的质量浓度为20 g/L 的基础上，参考茶粉颗粒直径相关文献[30]，以马铃薯（A）、葡萄糖（B）、红土（C）、茶叶种类（D）、茶粉颗粒大小（E）为因子，设计L16（45）正交试验（表1），每处理3 次重复，以多糖产量为主要指标，并综合其他指标设计筛选出最佳的组合。

表1 正交试验因素与水平设计Table 1 Orthogonal test factor and level design

1.2.4 指标测定 发酵液的颜色参照日本传统色彩CMYK 标准色卡进行比对测定；邀请10 位食品科学专业且味觉敏感的大学生组成评定小组，采用感官评价法测定发酵液的味道，以甜味、酸味、涩味、苦味、甘甜五个主要感官标准来评价，每个标准又分为轻微、适中、较重三个程度，综合考虑各味道的标准和程度作为试验结果；取过滤后的发酵液80 mL，在4000 r/min 转速下离心10 min，取1/2 体积上清液，置于旋转蒸发仪上浓缩至20 mL，再将得到液体用95%的乙醇溶液定容至40 mL，装入三角瓶，置于4 ℃温度下静置12 h，4000 r/min 下离心10 min，弃上清液，取沉淀37 ℃下烘干、称重，即为胞外粗多糖含量（g/L）[31]；取上述发酵液，采用数字折光仪上测定其可溶性固形物[32]；用酸度计测定pH[33]；记录菌球的形状与表面特征，取100 粒菌球，置于培养皿内排成一排直线，测量其长度，计算其菌球直径（mm）[34]；取10 mL 初始发酵液检测菌球的数量，并计算菌球总数（个/L）；发酵液经200 目筛过滤后的记录菌球湿重，37 ℃下烘干至恒重，测定菌球干重（g/L），即为菌球生物量[35]。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0 软件对试验数据进行显著性（P＜0.05）、相关性以及通径分析[36]，每组实验重复测定三次，结果均用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同马铃薯添加量对白灵芝液体培养特性的影响

由表2 可知，马铃薯为100 g/L 时，其胞外粗多糖产量与菌球生物量最大，分别达到0.15 g/L、4.82±0.55 g/L；马铃薯为200 g/L 时，白灵芝菌球数量（404.45±54.54 个/L）与菌球直径（11.24±1.75 mm）最大；马铃薯为300 g/L 时，菌丝萌发（2 d）与菌球形成（3.3 d）时间最短，白灵芝发酵液可溶性固形物含量（1.33%±0.15%）与pH（4.16）均最大，上述所有最大值与其相应同列最小值相比差异均显著（P＜0.05）。同时，马铃薯为200 g/L 时发酵液呈淡黄色，微酸，其余处理均为半透明色、淡菌香味；菌球为球形，表面有少量毛刺。总之，适宜的马铃薯添加量能显著提高该菇胞外粗多糖的产量，正交试验中其4 个水平设置为50、100、200、300 g/L。

表2 不同马铃薯添加量对白灵芝液体培养特性的影响Table 2 Effects of different potato additions on the liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

2.2 不同葡萄糖添加量对白灵芝液体培养特性的影响

由表3 可知，不同葡萄糖添加量对白灵芝液体培养特性的影响较大，葡萄糖为0 g/L 时菌丝萌发（2 d）与菌球形成（3 d）时间最短，其发酵液pH（5.16）最大，葡萄糖为10 g/L 时其胞外粗多糖产量（0.36±0.02 g/L）与菌球数量（1631.11±93.65 个/L）均最大，葡萄糖为30 g/L 时其发酵液可溶性固形物含量（1.87%±0.06%）、菌球生物量（6.34±1.14 g/L）、菌球直径（15.21±1.99 mm）均最大，上述所有最大值与其他梯度相比差异均极显著（P＜0.01）。同时，4 个处理发酵液均为淡黄色，以淡菌香味为主，其中处理4有轻微酸味；菌球为球形，表面有少量毛刺。总之，添加葡萄糖均能极显著提高该菇胞外粗多糖的产量，正交试验中的4 个水平分别设置为10、20、30、40 g/L。

表3 不同葡萄糖添加量对白灵芝液体培养特性的影响Table 3 Effects of different glucose additions on the liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

2.3 不同红土添加量对白灵芝液体培养特性的影响

由表4 可知，发酵液红土添加量为2 g/L 时，其菌球形成时间（3 d）最短，发酵液pH（4.18）与菌球数量（491.11±74.33 个/L）均达到最大；未添加红土时，该菇胞外粗多糖产量（0.55±0.04 g/L）、菌球生物量（7.14±0.28 g/L）、菌球直径（12.88±0.75 mm）均最大；红土添加量为1 g/L 时，其菌丝萌发时间最短（2 d）。除发酵液酸碱度外，上述所有最大值与其相应同列最小值相比差异均显著（P＜0.05）。同时，4 个处理发酵液为淡黄色，以淡菌香味为主，但添加2 g/L 红土配方上为香甜味；菌球为球形，除未添加红土配方菌球毛刺较多外，其他处理表面毛刺较少。总之，添加红土不利于该菇胞外粗多糖的分泌，但为验证是否与其它因素存在交互作用，故设置其正交4 个水平分别为0.5、1、2、3 g/L。

表4 不同红土添加量对白灵芝液体培养特性的影响Table 4 Effects of different red soil additions on the liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

2.4 不同茶叶添加量及其处理方式对白灵芝液体培养特性的影响

试验结果表明，不同茶叶（以绿茶为代表）浓度对白灵芝液体培养特性的影响较大，由表5 可知，未添加绿茶茶汤时，该菇菌丝萌发（2 d）与菌球形成（3 d）时间最短，其发酵液可溶性固形物含量（1.27%±0.12%）、菌球数量（1153.33±80.00 个/L）、菌球生物量（4.42±0.32 g/L）均最大；绿茶添加量为16 g/L 时，发酵液pH（5.61）、菌球直径（33.51±3.63 mm）均最大；绿茶添加量为20 g/L 时，其胞外粗多糖含量（0.29±0.03 g/L）最大。上述所有最大值与其他梯度相比差异均显著（P＜0.05）。同时，4 个处理发酵液为深褐色，淡菌香味和茶香味；菌球球形，毛刺多。总之，添加绿茶能极显著提高该菇胞外粗多糖的产量，且不同茶叶种类其营养成分差距较大，为获得更多胞外粗多糖产量，故固定茶叶的浓度为20 g/L，设置不同种类的茶叶（绿茶、白茶、红茶、普洱茶）作为正交试验的4 个水平。

表5 不同绿茶添加量对白灵芝液体培养特性的影响Table 5 Effects of different green tea additions on the liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

由表6 可知，该菇在2 种茶叶处理方式上其菌丝萌发时间相同，其中添加茶粉浓度为20 g/L 的培养基上该菇胞外粗多糖产量是茶汤处理上的5.07 倍，除发酵液可溶性固形物（0.97±0.06%）与pH（4.61）外，其余参数均明显高于茶汤组，故添加茶粉更有利于多糖分泌和菌丝体生长，且菌液具有清香味，菌香味更浓。总之，为探究不同茶叶颗粒大小对该菇胞外粗多糖产量的影响，故设置不同茶粉颗粒大小（1.5、0.9、0.15、0.075 mm）作为正交试验的4 个水平。

表6 不同绿茶处理方式对白灵芝液体培养特性的影响Table 6 Effects of different green tea treatments on liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

2.5 正交试验组合对白灵芝液体培养特性的影响

由表7 可知，极差分析法结果显示，5 个因素对白灵芝胞外粗多糖分泌的影响从大到小顺序为：葡萄糖＞茶叶种类＞红土＞马铃薯＞茶粉颗粒大小，其最优组合（A2B4C4D4E4）与显著性分析（A1B4C4D4E4）结果不一致，经进一步验证试验，该菇在组合A1B4C4D4E4上除发酵液pH 与菌球直径值均略小于组合A2B4C4D4E4外，其余参数均优于后者，其中胞外粗多糖产量达到1.49±0.33 g/L。因此，以胞外粗多糖为指标，最优组合为：马铃薯50 g/L、葡萄糖40 g/L、红土3 g/L、普洱茶20 g/L、茶粉颗粒大小0.075 mm。

表7 以胞外粗多糖产量为指标的极差分析表Table 7 Range analysis table with extracellular crude polysaccharide production as index

由表8 可知，16 种正交组合对该菇液体培养特性影响较大，其中该菇在配方9、配方16 上菌丝萌发（2 d）与菌球形成（3 d）时间均最短，配方12 均最长；其发酵液可溶性固形物含量（4.87±0.25%）、pH（4.89）、菌球直径（12.90±8.32 mm）、菌球数量（5493.33±170.10 个/L）、菌球生物量（32.18±5.19 g/L）分别在配方12、配方6、配方9、配方4、配方8 上最大，而在配方5、配方1、配方4、配方13、配方9 上最小，且上述所有最大值与其他梯度相比在0.05 与0.01 水平上差异均显著（P＜0.05）。同时，发酵液多为枯茶色和赤褐色（图1），以甜菌香味为主且伴有清凉和微涩口感；菌球以球形或卵形为主，少数不规则，均有毛刺，配方3 和11 毛刺较长，配方4、6、7 毛刺较短，配方9、11、12 发酵液较清澈。

图1 不同正交组合下白灵芝在摇瓶内菌丝培养情况Fig.1 Mycelial culture of Ganoderma leucocontextum in shake flasks under different orthogonal combinations

表8 不同正交组合对白灵芝液体培养特性的影响Table 8 Effects of different orthogonal combinations on liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

2.6 白灵芝胞外粗多糖含量与其它液体培养特性相关性与通径分析

由表9 可知，白灵芝的胞外粗多糖含量与发酵液pH、菌球生物量呈不显著正相关，与发酵液可溶性固形物、菌球数量呈显著正相关（P＜0.05），与菌丝萌发时间、菌球形成时间、菌球直径呈不显著负相关（P＞0.05）。因此，该菇胞外粗多糖含量与其它液体培养特性之间均存在一定程度的相关性。

表9 胞外粗多糖含量与其它液体培养特性相关性Table 9 Correlation between extracellular polysaccharide content and other liquid culture characteristics

上述相关性仅表明白灵芝胞外粗多糖含量与其它液体培养特性之间的直接关系，需要通过逐步回归分析法把上述相关性分解为直接作用与间接作用，以明确不同液体培养特性的相互作用对该菇胞外粗多糖分泌的影响。

以胞外粗多糖含量为因变量Y，菌丝萌发时间、菌球形成时间、可溶性固形物含量、pH、菌球直径、菌球数量、菌球生物量分别为自变量X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7，剔除回归系数不显著的自变量，建立多元线形回归方程Y=0.048+0.111X3+9.939X6（F=28.365，P=0.000＜0.01）且该方程F检验达到极显著，有必要再次做通径分析。

由表10 可知，在与胞外粗多糖含量（Y）的相关性中，自变量与Y 的相关系数、直接通径系数以及决策系数均为X6＞X3，间接通径系数总和却相反（X3＞X6），说明X6对Y 的相关程度、直接作用、综合作用均大于X3，X3通过X6对Y 的间接作用大于X6通过X3对Y 的间接作用（0.120＞0.083），即发酵液可溶性固形物含量对该菇胞外粗多糖分泌的间接影响大于其菌球数量，但菌球数量对其分泌的直接作用与综合作用最大（R2=0.588）。

表10 以胞外粗多糖含量为因变量的通径分析Table 10 Path analysis referring to extracellular polysaccharide content as dependent variables

3 讨论与结论

营养物质与环境因素是大型真菌生长发育的主要影响因素之一，各种因素的胁迫下菇体的培养特性及其代谢产物差异较大，香菇[37]、白桦茸[26]、羊肚菌[38]等。同时，灵芝菌在茶培养基中进行发酵时，处于一个陌生的生活环境中，因而生理特性发生较大改变，对灵芝菌丝体形态、生长以及代谢产物的合成产生一定的影响[39]。

本研究结果显示：马铃薯和红土浸出液能缩短菌丝萌发和菌球形成时间，提高发酵液可溶性固形物含量、菌球数量，说明马铃薯富含淀粉等碳水化合物[40]，是一种优质的碳源[25]，红土浸出液又有利于大型真菌液体培养[27]且富含无机盐类、微量元素、有机物等营养成分，这两种添加物为菌丝的萌发与成球提供了充足的能量和各类营养物质，同时，白灵芝发酵过程中会利用这些营养物质进行代谢，产生糖类、有机酸、维生素等代谢产物，从而提高发酵液的可溶性固形物含量。葡萄糖能增加白灵芝发酵液可溶性固形物含量、菌球数量、菌球生物量，并增大菌球直径，说明葡萄糖是大型真菌液体发酵较为适宜的碳源，既能增加菌丝生物量，又能促进糖类等代谢产物的积累[26]，同时，葡萄糖作为一种单糖，为菌球的形成和体积的增大提供充足的碳源和能量。茶叶能提高白灵芝发酵液的pH 和胞外粗多糖产量且茶粉优于茶汤，与灵芝（Ganoderma lucidum）菌的研究结果一致[24]，说明茶叶中的某些营养物质可以作为白灵芝的碳源和能量，从而促进其胞外粗多糖的合成，茶叶中含有大量的茶碱等碱性物质，可以中和发酵液中固体分泌的有机酸等酸性物质，从而提高发酵液的酸度。同时，茶粉营养物质多于茶汤，更适合作为该菇的液体发酵培养基成分。白灵芝胞外粗多糖的分泌与菌丝萌发时间、菌球形成时间和菌球直径呈负相关，与菌球数量、菌球生物量、可溶性固形物等呈正相关，说明绿茶中一些多酚类等抗菌物质抑制了灵芝的菌丝生长[24]，同时，菌球数量、菌球生物量[41]、可溶性固形物含量越大，大型真菌胞外粗多糖分泌越多。最后，除茶叶颗粒大小外，白灵芝高产胞外粗多糖的最佳营养条件组合与其单因素最佳水平均不相符，尤其葡萄糖与茶叶种类（普洱茶优于其它茶叶）是影响其产量的主要因素，说明不同单因素营养条件或正交组合下该菇胞外粗多糖的分泌存在差异，葡萄糖能为该菇胞外粗多糖的形成快速提供足够的碳源和能源，同时，普洱茶作为白灵芝高产胞外粗多糖的发酵基质，极有可能与普洱茶比绿茶、红茶、白茶含有更多的茶多糖有关[42]。

总之，白灵芝发酵茶培养基受营养物的种类、浓度、颗粒大小等影响较大，可溶性固形物含量对该菇胞外粗多糖的分泌间接影响最大，菌球数量对其直接作用与综合作用最大，除此之外，该菇高产多糖新品种的选育、多糖的结构与功效分析、多糖的临床应用等有待深入研究。