超高效液相色谱-串联质谱法检测乳清蛋白粉中神经节苷脂GD3

宋戈，苗晶，孙立庆，高珊，徐慧，许瑞敏，李筱薇

（1.黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨 150028；2.美赞臣婴幼儿营养品研发中心有限公司，广州 510000）

0 引 言

神经节苷脂在大脑发育和功能中具有重要作用，与婴儿免疫系统调节和肠道发育成熟有关，还有细胞黏附、分化和增殖、调节离子通道和神经递质释放的细胞功能[1-2]。神经节苷脂是组织和血液中细胞质膜的一部分，其在神经组织如大脑中的浓度最高。在牛奶中，它们是乳脂球膜的一部分[3-4]，双唾液酸神经节苷脂GD3和单唾液酸神经节苷脂GM3是牛奶和乳制品主要的神经节苷脂，其中神经节苷脂GD3分别占牛乳和牛乳清蛋白粉中神经节苷脂总含量的60%和80%，而GM3仅以微量存在[5-7]。早期采用薄层色谱法，通过间苯二酚反应染色或比色法测定神经节苷脂总量[8]，采用反相高效液相色谱-紫外检测方法分离直接测定和量化以其过氧化苯甲酰或对硝基苯胺衍生物形式存在的神经节苷脂[9-11]。近年来，飞行时间质谱技术以其可获得结构信息、高选择性和高灵敏度等优点，在神经节苷脂的构成和测定中发挥了重要的作用[12-23]，对仪器配备要求高。也有采用串联四级杆质谱对神经节苷脂定量测定[24-35]，要求标准物质和样品中神经节苷脂GD3的分子种类一致，需要测定神经节苷脂GD3每个分子类别的含量再加和，样品中含量占比低的神经节苷脂GD3分子种类可能检测不到，而且神经节苷脂分子类别繁多，计算复杂，对分离要求高。

本方法针对乳清蛋白粉，通过三氯甲烷甲醇溶液提取，除去样品中蛋白质，再经甲醇水溶液反萃取，利用硅胶色谱柱分离，超高效液相色谱-串联质谱多种扫描模式测定神经节苷脂GD3，并在实际样品的检测中得以应用，为进一步研究强化神经节苷脂的食品检测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

AB4500 超高效液相色谱串联质谱仪，配有电喷雾离子源，美国AB 公司；TTL-DCⅡ水浴加热仪，北京同泰联科技有限公司；pB-10 酸度计，德国Sartorius公司；KQ-250DE 超声波振荡器，昆山市超声仪器公司；VORTEX3 涡旋混合器，德国IKA 公司；SQP 天平，分度值为0.0001 g，德国Sartorius 公司。

1.2 试剂与材料

神经节苷脂GD3，从牛酪乳中分离得到以铵盐形式存在（纯度≥98%），美国Matreya 公司；乙腈、乙酸铵、三氯甲烷、甲醇均为色谱纯，购自德国默克公司；冰乙酸和氯化钾为优级纯，天津科密欧公司。所有用水均为电阻率≥18.2 MΩ·cm 的超纯水，以上试剂除标注的外均为分析纯。

1.3 标准溶液的制备

神经节苷脂GD3标准储备溶液：称取适量的（精确至0.1 mg）神经节苷脂标准物质于10 mL 容量瓶中，用甲醇-水溶液(V甲醇：V水=1：1)溶解并定容，折算纯度后达到1.0 g/L。-18 ℃保存，有效期1 周。

神经节苷脂GD3标准工作溶液：准确吸取神经节苷脂标准储备溶液1.0 mL 到10 mL 容量瓶中用甲醇-水溶液(V甲醇：V水=1：1) 定容，摇匀后再吸取0、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、2.50 mL 至10 mL 容量瓶中，用甲醇-水溶液(V甲醇：V水=1：1)定容摇匀。标准工作溶液浓度分别为0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 和25.0 μg/mL，临用前配制。

1.4 实验条件

1.4.1 UPLC-MS/MS 条件

色谱条件：Syncronis HILIC 色谱柱（1.7 μm，100 mm×2.1mm），柱温为25 ℃，进样体积为5 μL，流动相体系为（A）95%乙腈5% 0.01 mol/L 乙酸铵溶液pH（5.6±0.5）和（B）50%乙腈50%0.01 mol/L 乙酸铵溶液pH（5.6±0.5）；流速为0.5 mL/min。梯度洗脱程序：0～3 min，99%A；3～6 min，99%A 匀速降至60%A；6～10 min，60%A；10～11 min，60%A 线性升至99%A，保持5 min。

质谱条件：电喷雾离子化（ESI）,负离子模式；离子化电压，4.5 kV；离子源温度，450 ℃；气帘气，0.22 MPa；雾化气，0.50 MPa；辅助加热气，0.50 MPa；采用多反应监测（MRM）模式采集数据进行定性分析，质谱参数如表1 所示。

表1 多反应监测模式参考质谱参数

采用母离子模式(Precursor Mode)采集数据进行定量测定，质谱参数如表2 所示。

表2 母离子模式参考质谱参数

1.4.2 样品处理

称取试样2.5 g，加入一级水25 mL 超声溶解，转移并用一级水定容50 mL，摇匀后准确吸取1.0 mL，加入4 mL 三氯甲烷-甲醇溶液(V三氯甲烷∶V甲醇=1∶2)于带盖离心管中涡旋混合，在混摇振荡器上振荡10 min，取出在4 000 r/min 下离心10 min，移取上清液于另一带盖离心管中，剩余沉淀物加1.0 mL 去离子水，振荡混匀后再加4 mL 三氯甲烷-甲醇溶液(V三氯甲烷∶V甲醇=1∶2)，涡旋混合后在混摇振荡器上振荡10 min，取出在4 000 r/min 下离心10 min 移出上清液，合并的上清液中加入2.0 mL 一级水，涡旋混合后在4 000 r/min下离心10 min，转移上层水相层于10 mL 容量瓶中，下层有机溶液再加入0.25 mL、0.01 mol/L 氯化钾水溶液和0.35 mL 甲醇，涡旋混合后在4 000 r/min 下离心10 min，转移上层水相层合并于10 mL 容量瓶中用甲醇定容，混匀后用0.22 μm 的有机膜过滤后上机测定。

1.4.3 定量测定

神经节苷脂GD3标准工作液和试样提取液注入超高效液相色谱串联质谱仪中测定，神经节苷脂多反应离子监测子离子色谱图如图1 所示，神经节苷脂GD3母离子扫描色谱图如图2 所示。

图1 神经节苷脂GD3 多反应离子监测子离子色谱

图2 神经节苷脂GD3 母离子扫描色谱

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择与优化

神经节苷脂GD3是一类鞘糖脂，由疏水性神经酰胺核和2 个唾液酸残基的亲水性寡糖链组成。该神经酰胺由鞘氨醇基主干和具有不同链长及饱和程度的脂肪酸组成[14-20]。通过质荷比在300～2 000 扫描范围内的神经节苷脂GD3标准溶液的母离子扫描，发现产生了一系列双电荷[M-2H]2-离子簇如图3 所示，占主导的离子有707.8、715.1、721.0、728.0、734.9、742.0、748.9、756.0、763.0、770.1、777.1、784.1，例如m/z 为770.1 的GD3分子在神经酰胺部分可能含有具备23 个碳原子和0 个双键的酰基脂肪酸、具备18 个碳原子和1 个双键的二羟基鞘氨醇碱基脂肪酸（表示为d23:0/18:1）[14-21]。基于结构中的神经酰胺部分，神经节苷脂GD3可以在反相柱上分离[18,24-25]，但需要将神经节苷脂GD3混合物中的不同脂肪酸构成的每一个神经节苷脂GD3分子种类分离，不能存在重叠现象才能准确定量，而且要求不同脂肪酸构成的每一个神经节苷脂GD3分子种类的标准溶液浓度准确。由于没有不同脂肪酸构成的每一个神经节苷脂GD3分子种类的标准品，只能通过对神经节苷脂GD3混合物标准溶液进行分离后采用面积归一化法确定标准溶液中不同脂肪酸构成的每一个神经节苷脂GD3分子种类的浓度，定量样品中对应的分子，最后把每种分子的含量加和，得到总神经节苷脂GD3的含量。

图3 神经节苷脂GD3 标样一级质谱扫描离子

对比反相色谱柱分离，利用结构中2 个唾液酸残基的亲水性寡糖链组成的共性，亲水相相互作用分离模式[29-31]，能够使神经节苷脂GD3混合物中的不同脂肪酸构成的每一个神经节苷脂GD3分子种类保留相同，共流出形成一个色谱峰，不需要确定不同脂肪酸构成的每一个神经节苷脂GD3分子种类的标准溶液浓度，从而便于定量。试验比对氨丙基团 (Thermo APS-2 HYPERSIL 150 mm×2.1 mm，3 μm)、两性离子基团(Agilent Poroshell 120 HILIC-Z 100 mm×4.6 mm，2.7 μm)和纯硅胶(Thermo Syncronis HILIC 100 mm×2.1 mm,1.7 μm) 色谱柱，采用1.4.1 色谱条件测定神经节苷脂GD3混合物标准溶液，如图4 所示。根据文献[14-15,29-31]采用乙腈和乙酸铵缓冲液作为流动相，基于硅胶色谱柱的亲水相相互作用分离模式，流动相的pH 会影响神经节苷脂的电离，影响峰形、响应和保留时间。为保证每种神经节苷脂GD3分子的充分离解，与硅胶色谱柱固定相产生的色谱行为和亲水作用力一样，共流出形成一个色谱峰，试验比对了1.4.1 色谱条件中流动相A 和B 的pH 为3 时与pH 为5.6 时测定神经节苷脂GD3混合物标准溶液，如图5 所示。当流动相pH 过大时，硅胶色谱柱固定相可能会发生流失。将有机相和水相进行预混，再分为流动相的两路，可以避免纯有机相和纯水相在梯度洗脱混合时带来的化学环境波动，保证整个分离过程中流动相的pH 稳定，所以确定了1.4.1 色谱条件。

图4 不同色谱柱分离神经节苷脂GD3 标样多反应离子监测离子色谱

图5 不同pH 的流动相分离神经节苷脂GD3 标样多反应离子监测离子色谱

2.2 质谱参数的选择与确定

根据MA L 等[14-15]，THAKKAR S K 等[25]和GIUFFFRIDA F 等[18]的研究，神经节苷脂GD3是一类化合物的混合物，有共同的子离子290/581，可以利用硅胶色谱柱的亲水相互作用分离模式共流出，试验采用质谱仪母离子扫描方式对神经节苷脂GD3定量，优化确定参数，如表2 所示。利用质谱仪对不同脂肪酸构成的每一个神经节苷脂GD3分子种类具有分离分辨的能力，同时采用了多反应通道选择性扫描方式对神经节苷脂GD3定量，优化确定参数，如表1 所示。试验采用母离子扫描方式和多反应通道选择性扫描方式同时对9 个乳清蛋白粉进行定量测定，并得到不同扫描方式测定的回收率和精密度。结果表明，样品采用母离子扫描方式定量测定的含量比多反应通道选择性扫描方式定量测定的含量偏高10%左右，但两者的回收率和精密度差别不大。根据MA L 等[14-15]，LEE H 等[16]和FONG B 等[29]的研究，乳清蛋白粉样品中不同脂肪酸构成的神经节苷脂GD3分子种类与神经节苷脂GD3标准物质有差异，导致多反应通道选择性扫描方式没有涵盖样品中某一些神经节苷脂GD3分子种类，测定结果偏低。采用母离子扫描方式定量测定能准确测定乳清蛋白粉样品中神经节苷脂GD3的含量，可以将标准品和样品中所有可能的分子种类包括在内，不会漏检，再利用多反应通道选择性扫描方式进行定性。

2.3 样品提取条件的优化

根据SVENNERHOLM L 等[28]和FONG B 等[29]所述方法对样品提取进行了优化。试验对比相同体积的样品溶液用相同体积的提取剂提取，提取剂中三氯甲烷与甲醇的体积对比不同乳清蛋白粉样品沉淀蛋白、分层以及转移操作的效果，如图6 所示，得到样品溶液用三氯甲烷与甲醇的体积比为1∶2 时，沉淀在底部便于转移上清液，提取效果较好。取1 mL 样品溶液用不同体积的三氯甲烷甲醇溶液(V三氯甲烷∶V甲醇=1∶2)提取, 在2.3 方法的条件下进行回收率的测定，如图7 所示，加入4 mL 三氯甲烷甲醇溶液(V三氯甲烷∶V甲醇=1∶2)时的回收率趋于稳定。提取后的提取液是三氯甲烷、甲醇与水的混合溶液，含有大量亲脂化合物。利用神经节苷脂的亲水性，以水为萃取剂，向提取液中加入水破坏相平衡而分层，促使亲脂化合物转移到三氯甲烷层中，神经节苷脂转移到甲醇水溶液层中，弃去下层三氯甲烷除脂，比较加入不同体积的水的效果，如图8 所示，同时按2.3 方法进行回收率的测定，得到加入2 mL 水时分层明显除脂效果较好，回收率也趋于稳定，如图9 所示。最后对转移完上层甲醇水溶液剩下的下层三氯甲烷进行第二次萃取，用少量0.01 mol/L氯化钾水溶液和甲醇有利于分层转移，完全提取目标物，又不影响定容，试验最终确定了1.4.2 样品处理方法。

图6 不同三氯甲烷与甲醇体积比的提取剂在提取样液中产生的效果

图7 不同体积的三氯甲烷-甲醇提取剂(V 三氯甲烷∶V 甲醇=1∶2)对回收率的影响(n=2)

图8 提取液中加入不同体积的水产生的效果

图9 提取液中加入水的体积对回收率的影响(n=2)

2.4 标准曲线和检出限

取不同浓度0、0.5、1.0、5.0 、10.0、20.0 和25.0 μg/mL的神经节苷脂GD3标准工作溶液，用超高效液相色谱串联质谱仪测定,采用母离子扫描方式定量和多反应通道选择性扫描方式定量，记录目标峰峰面积。以峰面积与标准溶液浓度绘制线性回归曲线，并以3 倍信噪比计算出样品称取2.5 g 的检出限，结果如表3 所示。

表3 不同扫描方式的线性和检出限

2.5 精密度和回收率

以同一个乳清蛋白粉为实验材料，称取2.5 g 样品后，再分别加入2.5 mg 和5.0 mg 的神经节苷脂GD3标样，对样品及2 个不同浓度的加标样品进行6 次平行测定，计算样品测定的精密度和回收率。超高效液相色谱串联质谱法采用母离子扫描方式测定和多反应通道选择性扫描方式测定的回收率和精密度如表4 所示。

表4 不同扫描方式在2 个水平下的加标回收率和精密度(n=6)

2.6 实际样品的测定

按照本方法对市售的乳清蛋白粉9 个样品进行神经节苷脂GD3含量的测定，结果如表5 所示。从实际样品的检测结果来看，超高效液相色谱串联质谱法无论采用母离子扫描方式测定，还是多反应通道选择性扫描方式测定，灵敏度和准确都可以满足实际测试的需求。

表5 不同扫描方式测定样品中神经节苷脂GD3 的含量(n=2)

3 结 论

研究了乳清蛋白粉样品中神经节苷脂GD3的提取条件、色谱分离条件和质谱检测参数，建立了超高效液相色谱-串联质谱测定乳清蛋白中双唾液酸神经节苷脂GD3的方法。该方法测定结果重现性好，准确度高，简单快捷，不要求标准物质和样品中神经节苷脂GD3的分子种类一致，样品中含量占比低的神经节苷脂GD3分子种类也能检测出，不需要测定神经节苷脂GD3每个分子类别的含量再加和，能简单方便地直接测定神经节苷脂GD3总量，能为乳清蛋白粉样品中神经节苷脂GD3含量的测定提供参考。