原生二十二碳六烯酸纯牛奶对小鼠学习记忆功能的辅助改善作用

任吴疆，郭月逸，赵建，郭豫，霍清，刘彦霞*

(1. 北京联合大学生物化学工程学院, 北京 100023; 2. 北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京 100191)

0 引 言

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）俗称“脑黄金”，是一种存在于大脑、神经组织和视网膜中的ω-3 多不饱和脂肪酸，对思维和记忆的形成起着重要作用[10-12]。DHA 在大脑中的含量较低，通过饮食补充已成为获取DHA 最有效的途径。临床研究表明，在新生儿配方中添加DHA 能够提高认知能力[13-16]。动物实验同样证实补充DHA 有助于提高学习记忆等相关机能[17-19]。目前常见的天然食品DHA 补充剂以深海鱼油为主，但由于其腥味较大，且对深海鱼类的过度捕捞可能会影响生态环境的可持续发展，因此寻找深海鱼油的替代品成为近些年的研究方向[20]。通过人工方法增加食品中DHA 的含量成为新的研究方向，乳制品作为婴幼儿的主要摄入食品，富含DHA 有助于脑部发育、提高学习记忆能力，直接将富含DHA 的产品加入牛奶中会因DHA 的氧化使营养价值低于预期，而将富含DHA 的藻粉经牛的消化系统转化至牛乳中，得到含有天然DHA 的生牛乳，经过加工后得到原生DHA 纯牛奶的方法合理优化了DHA 氧化带来的风味影响，与普通牛奶相比，不仅让消费者更容易接受，而且大大提高了营养价值。本研究观察该原生DHA 纯牛奶产品对小鼠学习记忆的影响，以期为DHA 产品的开发提供新的思路和理论依据，从而更好地促进人体健康发育。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品和动物

样品处理：将原生DHA 纯牛奶（市售）经7 500 r/min离心处理后得到乳黄色油状稀奶油（比重：0.97；DHA含量：0.417 g/100 g），冷藏保存。受试物配置方法：低剂量组：抽取稀奶油样品0.17 mL 后再添加无菌水至1.00 mL；中剂量组：抽取稀奶油样品0.33 mL 后再添加无菌水至1.00 mL；高剂量组：使用样品原液直接灌胃，为了保证受试物均匀不出现分层现象配制均在注射器中进行，供实验使用。

实验动物：288 只SPF 级KM 种雄性小鼠18～22 g饲养于北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心SPF 级动物房，饲养室温度为（20±2）℃、相对湿度为45%～60%，经过适应性饲养观察后，实验动物随机分为3 组，分别进行跳台实验、避暗实验和水迷宫实验。动物和饲料均由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2017-0038，实验动物质量合格证：No.110322220100118363、No.110322221100886426。

1.1.2 试剂

东莨菪碱（批号：D2017146，纯度98%），阿拉丁科技（中国）有限公司。

1.1.3 仪器

Centrifuge 5810R 台式离心机，德国eppendorf 公司；T1000 电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；BS2202S 电子天平，德国赛多利斯公司；DM1-001 电子秒表，上海精密仪器仪表有限公司；YLB-3TB 跳台记录仪，北京众实迪创科技发展有限责任公司；LE870 系列避暗箱，西班牙PanLab 公司；水迷宫，北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室自制。

《人力资源社会保障部 食品药品监管总局关于表彰全国食品药品监督管理系统先进集体和先进工作者的决定》影印件

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药

每组动物根据实验需要随机设置为2 个动物模型，每个模型1 个对照组和3 个剂量组，低、中、高3个剂量组分别为人体推荐剂量的5 倍、10 倍、30 倍，依据《保健食品检验与评价技术规范》（2003 版）高剂量相当于人体剂量为80 mg DHA/（人·天）；详细分组情况如表1 所示。

表1 实验动物分组设计表mg/kg 体质量

灌胃体积为10 mL/kg 体质量，对照组灌胃相同体积的无菌水，共计30 d，灌胃结束后测定各项指标。模型对照组和模型各剂量组在训练前10 min 腹腔注射东莨菪碱5 mg/kg 体质量，注射体积为10 mL/kg体质量。本研究动物实验设计和实施方案通过了北京联合大学伦理委员会审核和批准。

1.2.2 跳台实验

参考文献[21]的方法，末次给样后第2 d 开始训练。训练过后，记录跳下平台的潜伏期和5 min 内跳下平台的次数。24 h 后再次测试，对小鼠第1 次跳下去的潜伏期、3 min 内受到电击的次数和动物数进行记录。训练间隔7 d 后，重新再测试1 次，为记忆消退实验。

1.2.3 避暗实验

参考文献[21]的方法，末次给样后第2 d 开始训练。将小鼠背朝洞口放入明室，对小鼠从明室到暗室遭受电击所需的时间和5 min 内被电击的次数记录下来。间隔24 h 后再次测试，记录进入暗室的潜伏期和5 min 内遭受电击的次数。训练间隔7 d 后，重新再测试1 次，为记忆消退实验。

1.2.4 水迷宫实验

参考文献[21]的方法，末次给样后第2 d 开始训练，在训练期间每天给样1 次。训练时间2 min，在训练时间内没有到终点的记为2 min。如图1 所示，每次训练时，将2 min 内没有到终点的小鼠引导到终点。末次测试时，对每组动物5 次训练和测试的总错误次数、到达终点总时间和2 min 内到达终点的动物数进行记录。训练间隔7 d 后，重新再测试1 次，为记忆消退实验。

图1 水迷宫构造示意图

1.3 数据处理

采用软件SPSS 26 进行统计学分析，以平均值±标准差（±SD）表示，用单因素方差分析，计数资料采用x2检验，P＜0.05 表示有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 原生DHA 纯牛奶对小鼠体重的影响

由图2、图3 可知，小鼠实验前的初始体重和灌胃受试物30 d 后的体重，不同批次的各剂量组与相应的对照组相比均无统计学差异（P＞0.05），说明初始体重较为均衡，原生DHA 纯牛奶对小鼠体重没有影响。

图2 各批实验小鼠的初始体重

图3 实验结束后各批小鼠的体重

2.2 原生DHA 纯牛奶对小鼠跳台实验的影响

在跳台实验中，小鼠被绝缘平台限制了活动范围，导致跳下平台遭到电击，所以在该实验中的潜伏期和错误次数能够反映出受试物对小鼠学习记忆的改善作用[22]。由表2 可知，与模型对照组相比，模型中剂量组测试期、消退期的潜伏期显著延长（P＜0.05），模型高剂量组测试期潜伏期显著延长（P＜0.05）。由图4可知，与模型对照组相比，模型低剂量组测试期错误次数显著减少（P＜0.05），模型中、高剂量组测试期错误次数极显著减少（P＜0.01），模型中剂量组重测期、消退期错误次数均显著减少（P＜0.05）。由图5 可知，与阴性对照组相比，各剂量组的测试期、重测期和消退期的错误动物数均无显著性差异（P＞0.05）；与模型对照组相比，模型中剂量组测试期、消退期错误动物数显著减少（P＜0.05）。原生DHA 纯牛奶在跳台实验中能够延长潜伏期、减少错误次数，表明该受试物可以明显改善小鼠的学习记忆能力。

图4 原生DHA 纯牛奶对小鼠跳台实验错误次数的影响

图5 原生DHA 纯牛奶对小鼠跳台实验错误动物数的影响

表2 原生DHA 纯牛奶对小鼠跳台实验潜伏期的影响

2.3 原生DHA 纯牛奶对小鼠避暗实验的影响

避暗实验通过利用小鼠喜暗厌明的习性，使它在进入暗室时遭受到电击，所以小鼠在避暗实验中的潜伏期和错误次数能够反映出该受试物对小鼠学习记忆的改善作用[23]。由表3 可知，与阴性对照组相比，中剂量组消退期潜伏期显著延长（P＜0.05），高剂量组测试期潜伏期显著延长（P＜0.05）；与模型对照组相比，模型高剂量组训练期、测试期潜伏期均显著延长（P＜0.05）。由图6 可知，与阴性对照组相比，中剂量组消退期错误次数显著减少（P＜0.05）；与模型对照组相比，模型各剂量组不同时期的错误次数虽无显著性差异，但可以看出结果有减少的趋势。由图7 可知，与阴性对照组相比，中剂量组消退期错误动物数显著减少（P＜0.05）；与模型对照组相比，模型各剂量组不同时期的错误动物数虽无统计学差异，但可以看出结果有减少的趋势。原生DHA 纯牛奶在避暗实验中能够延长小鼠错误潜伏期、减少小鼠错误次数，表明该受试物可以明显改善小鼠的学习记忆能力。

图7 原生DHA 纯牛奶对小鼠避暗实验错误动物数的影响

表3 原生DHA 纯牛奶对小鼠避暗实验潜伏期的影响

2.4 原生DHA 纯牛奶对小鼠水迷宫实验的影响

水迷宫实验通过小鼠的方向感和空间位置感反映学习记忆能力，所以小鼠在该实验中到达终点的时间和错误次数能够反映出受试物对小鼠学习记忆的改善作用[23]。由表4 可知，与阴性对照组相比，各剂量组不同时期到达终点的总时间虽无统计学差异，但可以看出结果有减少的趋势；与模型对照组相比，模型中剂量组到达终点的总时间显著减少（P＜0.05）。由图8可知，实验各剂量组与相应对照组比较，错误次数虽无统计学差异，但可以看出错误次数的结果有减少的趋势。由图9 可知，各剂量组与相应对照组比较，到达终点动物数均无统计学差异（P＞0.05）。原生DHA 纯牛奶在水迷宫实验中能够减少小鼠到达终点的时间，从结果看出错误次数有减少的趋势，表明该受试物在水迷宫实验中可以改善小鼠的学习记忆能力。

图8 原生DHA 纯牛奶对小鼠水迷宫实验错误次数的影响

图9 原生DHA 纯牛奶对小鼠水迷宫实验到达终点动物数的影响

表4 原生DHA 纯牛奶对小鼠水迷宫实验到达终点时间的影响

3 结 论

学习记忆是生物体基本的认知功能，也是生物生存和进化的一种复杂高级神经活动[24]。作为“脑黄金”的DHA，由于对大脑中复杂的学习和记忆机制有着关键性的作用，所以认知科学领域的相关研究受到世界各国科学家的广泛关注，而近些年DHA 营养强化型食品成为了研究的重点[25-27]。微藻作为一种未被完全开发的丰富海洋资源，大多数微藻中都含有较为丰富的DHA，包括我国在内的多个国家都已批准可将富含DHA 的藻油添加进婴幼儿和成人食品中，为人体学习记忆所需的营养提供保障[28-29]。将处理的微藻粉添加进奶牛的饲料，通过脂肪酸代谢进入奶牛的血液和乳汁产出的原生DHA 纯牛奶不仅风味、口感和货架期与普通纯牛奶无明显差异，还在一定程度上成为了富集DHA 牛奶的有效策略[30-31]。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是一种被称为神经营养因子的蛋白质家族，分布在脑内和外周血清，在学习和记忆中起着重要作用，是DHA 潜在的下游靶目标[32-33]。研究表明，溶血磷脂酰胆碱-DHA通过增加BDNF 的水平增强了小鼠的学习记忆能力，但其机制尚不清楚[11]。LI J[34]等通过鱼油和胆碱的联合摄入，上调了关键转运蛋白的表达，增加了小鼠大脑中DHA 的生物利用度，增强了小鼠的学习和记忆能力。

本研究通过跳台实验、避暗实验和水迷宫实验3项行为学实验分析了原生DHA 纯牛奶对小鼠学习记忆的辅助改善作用，实验结果表明中、高剂量组和模型中、高剂量组可以延长跳台实验潜伏期、减少错误次数，延长避暗实验潜伏期、减少错误动物数，减少水迷宫实验到达终点总时间。小鼠在绝缘跳台和明室停留的时间越久、错误次数越少，水迷宫实验到达终点时间和错误次数越少，说明该样品改善学习记忆的作用越好[35]。综上所述，以上行为学实验结果表明原生DHA 纯牛奶具有改善小鼠的学习记忆的功能，但其量效关系和作用机制尚不明确，我们将在后续研究中进一步探究原生DHA 纯牛奶改善学习记忆的相关机制。