南极磷虾磷脂的组成及其抗氧化活性

刘小芳，郭向融，2，李爽，辛云，2，蒋永毅，冷凯良，姜维

（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部极地渔业可持续利用重点实验室，山东青岛 266071；2.浙江海洋大学国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山 316022；3.青岛菲优特检测有限公司，山东青岛 266112）

受全球渔业资源衰退的影响，南极磷虾作为可持续的渔业替代资源，近年来得到广泛关注[1]。南极磷虾生物量可达6.5～10亿t，南极海洋生物资源养护委员会制定的谨慎性捕捞限额为561 万t，而目前实际年捕捞量为20～40 万t，因此，南极磷虾资源的开发潜力巨大[2⁃3]。目前，国际南极磷虾渔业已进入第二次快速发展期[2]，我国南极磷虾渔业经过10 余年发展也已初具规模，集生态高效捕捞与船载工业化加工于一体、由陆基高附加值产品拉动的产业链基本形成[2⁃3]。南极磷虾富含优质的蛋白质、脂质、几丁质等成分[4⁃7]，是良好的营养健康食品和生物医药制品的生产原料，但目前精深加工产品仅有南极磷虾油和南极磷虾蛋白肽[1⁃2]，资源整体的高值化利用程度仍然不高，一定程度上限制了产业链的深度延伸和产业价值的有效提升。挖掘并明确南极磷虾营养成分的活性作用，对于指导南极磷虾高值产品开发和拓展产品应用领域十分必要。

磷脂是分子结构中结合有磷酸基团的极性脂质成分，其不仅是构成生物细胞膜的基础物质，同时参与多种营养成分的消化、吸收和运输过程，在调节机体的生理机能和代谢稳态中发挥至关重要的作用[8]。因磷脂抗氧化能力良好，其作为添加剂和营养补充剂已应用于食品、化妆品和功能制品等领域[9]。目前商品化生产的磷脂主要提取自大豆、卵黄等陆基食品原料，为满足市场发展的需求，水产食品原料来源磷脂的开发在近年来备受关注[10⁃11]，从大黄鱼鱼卵[12]、鲭鱼[13]、三文鱼鱼骨[14]、草鱼头[15]、近江牡蛎[16]中提取的磷脂陆续被证明抗氧化能力显著。南极磷虾的总脂含量丰富，磷脂占比达到总脂含量的40%左右[5，17⁃18]，是提取、生产磷脂的优质原料，但目前关于南极磷虾磷脂的抗氧化活性鲜见报道。综上，本研究以南极磷虾油为原料进行南极磷虾磷脂的分离纯化，以大豆磷脂和卵黄磷脂为对照，对南极磷虾磷脂的组成特征和抗氧化活性进行分析评价，旨在为南极磷虾磷脂在抗氧化制品领域的应用提供数据支持，为南极磷虾脂质类高值产品的定向开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾油：青岛南极维康生物科技有限公司；大豆磷脂、卵黄磷脂（纯度均≥90%）：北京索莱宝科技有限公司；玻璃层析柱（80 mm×500 mm）、薄层层析硅胶板（GF254）、柱层析硅胶（200～300 目）：青岛胜海精细硅胶化工有限公司；37 种脂肪酸甲酯混标、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphati⁃dylethanolamine，PE）等标准品（纯度均≥98%）、正己烷（色谱纯）、异丙醇（色谱纯）：默克生命科学有限公司；1，1⁃二苯基⁃2⁃三硝基苯肼（1，1⁃diphenyl⁃2⁃picrylhy⁃drazyl，DPPH）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；2，2′⁃联氮⁃双⁃3⁃乙基苯并噻唑啉⁃6⁃磺酸[2，2′⁃azino⁃bis（3⁃ethylbenzothiazoline⁃6⁃sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海麦克林生化科技股份有限公司；抗坏血酸：西陇化工股份有限公司；氯仿、丙酮、乙醚、硫酸：青岛润嵩化学科技有限公司；甲醇、乙醇、正己烷、乙酸、三氯乙酸、过硫酸钾、铁氰化钾、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲酸铵：国药集团化学试剂有限公司。除特殊标记外，其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BAS 224S⁃CW 型电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Neofuge 15R 高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；RE52AA 型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；MD 200 型氮吹仪：杭州奥盛仪器有限公司；LC⁃16 型液相色谱仪（配置Essentia ELSD⁃16 型蒸发光散射检测器）：日本岛津公司；HP 6890 型气相色谱仪[配置氢火焰离子检测器（flame ionization detector，FID）]：美国安捷伦公司；ST 3100 型pH 计：奥斯豪仪器（常州）有限公司；HH⁃4 型数显恒温水浴锅：常州智博瑞仪器制造有限公司；UV 1102Ⅱ型紫外可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 南极磷虾磷脂分离纯化

参考文献[19]的方法进行分离纯化，800 g 柱层析硅胶于110 ℃活化12 h，冷却至室温后，采用湿法装柱，待硅胶沉降完全后，用氯仿进行压柱，使层析柱中的硅胶装填密实。用少量氯仿溶解30 g 南极磷虾油，缓慢倒入层析柱中，使样品与硅胶充分吸附，然后依次用20 倍柱体积的氯仿和丙酮进行洗脱，经薄层层析色谱[展开剂为正己烷∶乙醚∶乙酸=85∶15∶1（体积比），碘蒸气显色]确认中性脂和糖脂去除完全后，更换洗脱液为20 倍柱体积的甲醇，继续洗脱，合并甲醇洗脱液，减压浓缩得到南极磷虾磷脂样品12.65 g。

1.3.2 大豆磷脂及卵黄磷脂纯化

参考文献[19]的方法进行纯化，大豆磷脂及卵黄磷脂采用20倍体积（体积质量比）经4 ℃预冷的丙酮反复洗涤3 次，收集丙酮不溶物，减压浓缩去除残留的有机溶剂，即得大豆磷脂和卵黄磷脂样品。

1.3.3 磷脂含量测定

按照GB/T 5537—2008《粮油检验磷脂含量的测定》中的钼蓝比色法进行测定。

1.3.4 磷脂组成测定

参照文献[17]的方法进行磷脂组成测定，适量分离纯化得到的磷脂样品，采用氯仿⁃甲醇溶液（2∶1，体积比）溶解，通过液相色谱法分析磷脂组成，不同磷脂组分经外标法定量后，分别计算各自在总磷脂中的比例。色谱条件：ZORBAX Rx⁃SIL 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温35 ℃；流速1 mL/min；进样量10 µL；漂移管温度60 ℃；雾化器压力0.17 MPa；流动相A为正己烷∶异丙醇∶5 mmol/L 甲酸铵（82∶17∶1，体积比）；流动相B为异丙醇∶水∶5 mmol/L 甲酸铵（85∶14∶1，体积比）；梯度洗脱程序：0 min A 与B 体积比为100∶0，5 min A 与B体积比为80∶20，7 min A与B体积比为60∶40，17 min A与B 体积比为30∶70，23 min A 与B 体积比为0∶100，25 min A 与B 体积比为0∶100，26 min A 与B 体积比为100∶0，30 min 洗脱程序结束。在20～500 mg/L 浓度范围内，以标准品质量浓度的对数值（X）为横坐标，以相应峰面积的对数值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，其中，PC 定量方程为Y=1.118 8X+3.430 9，R2=0.998 7；PE 定量方程为Y=1.339 3X+2.786 2，R2=0.997 6。

1.3.5 脂肪酸组成测定

参照文献[17]的方法进行脂肪酸组成测定，适量分离纯化得到的磷脂样品经甲酯化处理后，采用气相色谱法测定脂肪酸组成，采用峰面积归一化法进行定量分析。色谱条件：INNOWAX毛细管柱（0.32 mm×30 m，0.25µm），检测器采用FID，载气为氮气；进样口参数：进样口温度240 ℃，分流比15∶1，进样量1µL；升温程序：起始温度170 ℃，以3 ℃/min升温至210 ℃，保持30 min；FID 参数：检测器温度250 ℃，氢气流速40 mL/min，空气流速450 mL/min，尾吹氮气流速40 mL/min。

1.3.6 ABTS+自由基清除能力测定

参照文献[20]的方法进行测定，将5 mL 7 mmol/L ABTS 溶液与88 mL 25 mmol/L 过硫酸钾溶液混合，室温避光储存12～16 h，采用乙醇稀释至734 nm 处吸光值为0.70±0.02，配制成ABTS 试剂。0.15 mL 不同浓度的磷脂乙醇溶液与3.0 mL ABTS 试剂混合，室温避光反应20 min，在734 nm波长下测定吸光值（A样品），用等量乙醇代替ABTS试剂测定相应吸光值（A空白），等量乙醇代替磷脂溶液测定相应吸光值（A对照），ABTS+自由基清除率（S，%）计算公式如下。

1.3.7 DPPH自由基清除能力测定

参照文献[12]的方法进行测定，不同浓度的磷脂乙醇溶液与等体积0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液混合，室温避光反应20 min，在517 nm波长下测定吸光值（B样品），用等量乙醇代替DPPH乙醇溶液测定相应吸光值（B空白），等量乙醇代替磷脂溶液测定相应吸光值（B对照），DPPH自由基清除率（R，%）计算公式如下。

1.3.8 还原能力测定

参照文献[15]的方法进行测定，1 mL 不同浓度的磷脂乙醇溶液，加入1 mL 超纯水和1 mL 0.1%铁氰化钾溶液，混匀后于50 ℃水浴避光反应20 min，快速冷却至室温后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液终止反应，5 000 r/min 离心10 min，取1 mL 上清液加入1 mL 超纯水和500 µL 0.1%氯化铁溶液，混匀后静置10 min，于700 nm 波长下测定吸光值（C样品），用0.05 mg/mL 抗坏血酸溶液代替磷脂样品测定相应吸光值（C对照），以磷脂样品可达到抗坏血酸还原效果的程度表征其还原能力，还原能力（Q，%）计算公式如下。

1.4 数据处理

结果以平均值±标准偏差的形式表示，采用Excel 2016、IBM SPSS 27.0、Origin 2018 软件进行数据处理和图形绘制。采用单因素方差分析进行组间多重比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾磷脂的组成特征

硅胶柱层析法是分离纯化制备高纯度磷脂的经典方法，氯仿⁃丙酮⁃甲醇依次洗脱是最常用的一种洗脱体系[10，21]。南极磷虾磷脂的组成、薄层层析色谱、脂肪酸组成分别如表1、图1、表2所示。

图1 南极磷虾磷脂的薄层层析色谱Fig.1 Thin layer chromatography of phospholipids from Antarctic krill

表1 南极磷虾磷脂的组成Table 1 Composition of phospholipids from Antarctic krill

表2 南极磷虾磷脂的脂肪酸组成Table 2 Fatty acid composition of phospholipids from Antarctic krill

由表1和图1可知，经硅胶柱层析纯化后得到的南极磷虾磷脂纯度较高，其磷脂含量达到（93.78±3.18）g/100 g。南极磷虾磷脂主要为PC，含有少量的PE，分别占总磷脂的（90.60±1.03）%和（5.08±1.10）%，这与卵黄磷脂的磷脂组成较为相似，而与大豆磷脂的磷脂组成差异显著（P＜0.05）。由表2 可知，南极磷虾磷脂中二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA，C20∶5）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，C22∶6）的含量丰富，分别占总脂肪酸含量的（31.75±0.24）%和（19.35±0.10）%，这与大豆磷脂富含亚油酸（C18∶2）和棕榈酸（C16∶0）、卵黄磷脂富含棕榈酸（C16∶0）和油酸（C18∶1）的脂肪酸组成特征明显不同，以上研究结果与已有文献报道一致[5，17，19，22]。综合磷脂组成和磷脂脂肪酸组成结果可知，南极磷虾磷脂是典型的海洋EPA/DHA 磷脂。已有研究指出，与大豆磷脂和卵黄磷脂等陆基食品原料来源磷脂相比，海洋EPA/DHA 磷脂的功能活性更优[23]。目前，大豆磷脂和卵黄磷脂已作为抗氧化剂被广泛使用[9]，南极磷虾磷脂在抗氧化方面的作用效果值得研究。

2.2 南极磷虾磷脂的ABTS+自由基清除能力

ABTS+自由基清除能力是评估抗氧化剂活性强弱的常用方法之一。ABTS在氧化剂作用下被氧化生成绿色的ABTS+自由基，抗氧化剂可抑制ABTS+自由基的产生[24]。南极磷虾磷脂的ABTS+自由基清除能力见图2。

图2 南极磷虾磷脂的ABTS+自由基清除能力Fig.2 ABTS+free radical scavenging ability of phospholipids from Antarctic krill

由图2可知，南极磷虾磷脂在10～50 mg/mL浓度范围内，ABTS+自由基清除率为（32.30±2.27）%～（98.70±0.58）%；随着磷脂浓度的升高，ABTS+自由基清除活性明显增强，并呈现浓度依赖效应。与已有报道的鲭鱼肌肉磷脂（浓度100 mg/mL时ABTS+自由基清除率约为90%）[13]、三文鱼鱼骨磷脂（浓度100 mg/mL 时ABTS+自由基清除率为55.60%）[14]相比，南极磷虾磷脂具有更强的ABTS+自由基清除能力。经计算，南极磷虾磷脂清除ABTS+自由基的IC50值为15.78 mg/mL，低于南极磷虾油（IC50值17.84 mg/mL）、大豆磷脂（IC50值30.42 mg/mL）和卵黄磷脂（IC50值31.36 mg/mL）。南极磷虾磷脂清除ABTS+自由基的效果显著优于大豆磷脂和卵黄磷脂（P＜0.05）。综上可知，南极磷虾磷脂具有良好的ABTS+自由基清除能力。

2.3 南极磷虾磷脂的DPPH自由基清除能力

DPPH 自由基是一种以氮为中心较稳定的自由基，其溶于乙醇后呈蓝紫色，与抗氧化剂相互作用后颜色变淡，通过颜色变化程度可判断抗氧化剂活性的强弱[24]。南极磷虾磷脂的DPPH自由基清除能力见图3。

图3 南极磷虾磷脂的DPPH 自由基清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging ability of phospholipids from Antarctic krill

由图3可知，南极磷虾磷脂在10～50 mg/mL浓度范围内，DPPH 自由基清除率为（36.14±1.32）%～（91.33±0.67）%；随着磷脂浓度的升高，DPPH自由基清除活性明显增强，并呈现浓度依赖效应。南极磷虾磷脂清除DPPH自由基的能力强于鲭鱼肌肉磷脂（浓度100 mg/mL时DPPH自由基清除率约为50%）[13]和三文鱼鱼骨磷脂（浓度100 mg/mL时DPPH自由基清除率为75.48%）[14]，但弱于大黄鱼鱼卵磷脂（浓度20 µg/mL 时DPPH 自由基清除率为47.80%）[12]。经计算，南极磷虾磷脂清除DPPH 自由基的IC50值为14.87 mg/mL，低于卵黄磷脂（IC50值15.07 mg/mL）、南极磷虾油（IC50值20.27 mg/mL）和大豆磷脂（IC50值24.21 mg/mL）。南极磷虾磷脂清除DPPH 自由基的作用效果与卵黄磷脂相近，明显优于大豆磷脂。综上可知，南极磷虾磷脂具有良好的DPPH自由基清除能力。

2.4 南极磷虾磷脂的还原能力

铁氰化钾与抗氧化剂混合后被还原成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾进一步与铁离子发生反应生成普鲁士蓝，其在700 nm 波长处有较大的吸收，吸光值越大则抗氧化剂的还原能力越强[15，25]。南极磷虾磷脂的还原能力见图4。

图4 南极磷虾磷脂的还原能力Fig.4 Reducing capacity of phospholipids from Antarctic krill

由图4可知，南极磷虾磷脂在10～50 mg/mL浓度范围内，其还原能力相当于抗坏血酸对照溶液还原能力的（25.88±0.59）%～（56.54±0.61）%；随着磷脂浓度的升高，还原能力明显增强，并呈现浓度依赖效应。南极磷虾磷脂的还原能力弱于南极磷虾油，推测这可能与南极磷虾油中含有虾青素[5]，而柱层析洗脱时极性较低的虾青素已与极性较高的磷脂实现分离有关。南极磷虾磷脂的还原能力明显优于大豆磷脂和卵黄磷脂，这与岳大鹏等[15]发现从草鱼头提取的海洋磷脂还原能力显著优于大豆磷脂的结果一致。综上可知，南极磷虾磷脂具有良好的还原能力。

3 结论

本研究采用柱层析法分离制备南极磷虾磷脂，并对其组成特征和抗氧化活性进行分析评价。组成分析结果表明：南极磷虾磷脂以PC 为主，含有少量PE；富含多不饱和脂肪酸，且主要为EPA 和DHA；南极磷虾磷脂是典型的海洋EPA/DHA 磷脂。抗氧化活性评价结果表明：南极磷虾磷脂具有良好的ABTS+自由基和DPPH 自由基清除能力以及还原能力，且其作用效果明显优于大豆磷脂和卵黄磷脂。不同来源磷脂的抗氧化活性差异明显，推测这与各磷脂中不同磷脂组分的比例、结合的多不饱和脂肪酸总量等存在差异有关。南极磷虾磷脂在抗氧化制品领域具有良好的应用前景，未来研究可关注其在生物体内发挥抗氧化的作用效果及内在机制。本研究对于指导南极磷虾高值产品开发以及支撑加工产业链深度延伸具有积极意义。