鸡蛋花不同极性部位总酚、总黄酮含量及生物活性

余咏诗，夏映池，李楠，陈鑫，刘辉，，杨安平，范丽霞，*

（1.佛山科学技术学院食品科学与工程学院，广东佛山 528225；2.佛山科学技术学院医学院，广东佛山 528000）

鸡蛋花（PlumeriarubraL.）为夹竹桃科（Apocyna⁃ceae）鸡蛋花属（Plumeria）植物，又名缅栀子、鹿角树等，原产于美洲热带地区，在我国主要分布于福建、广东、广西和海南等省区[1]。鸡蛋花是岭南地区常用药食同源草药，同时也是广东著名凉茶“五花茶”的原料之一，其味甘、淡，性凉，具有清热解毒和润肺止咳的功效，人们常将其泡成茶水饮用从而达到预防中暑的目的[2⁃3]。目前，已从鸡蛋花中分离得到环烯醚萜[4⁃5]、三萜[6]、挥发油[7]、黄酮[8]等化学成分。现代药理研究表明鸡蛋花具有抗病毒[9]、抗菌[7]、镇咳[10]等作用。

多酚类、黄酮类物质在抗炎[11]、抗氧化[12⁃13]、保肝[14⁃15]、抗肿瘤[16]等方面均具有较好的活性，在食品、调味品、保健和医药领域具有广阔的应用前景。近年来，对鸡蛋花的研究主要集中在鸡蛋花药理功效[17]、栽培技艺[18]和单一化学成分的分析上[3]，仅有少数研究关注鸡蛋花的总黄酮及其抗氧化性。邓金生等[19]研究鸡蛋花的70%乙醇提取物的抗氧化能力，发现其提取液浓度为0.01 g/mL 时对DPPH 自由基的清除效率可达93.99%；陈遂等[20]通过超声波⁃十二烷基硫酸钠（so⁃dium dodecyl sulfate，SDS）协同提取鸡蛋花总黄酮并测定其自由基清除能力，研究发现鸡蛋花总黄酮具有良好的自由基清除效果，其中对羟自由基清除率最高。

目前对鸡蛋花提取物中各萃取部位多酚和黄酮类含量、抗菌、抗肿瘤活性的研究较少，因此本试验对鸡蛋花不同溶剂萃取部位的总酚及总黄酮含量进行测定，并对其抗菌、抗氧化、抗肿瘤活性进行研究，旨在为鸡蛋花的进一步开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋花：亳州键安堂有限公司；芦丁对照品、没食子酸标准品（色谱纯度≥98%）：成都德思特生物技术有限公司；福林酚、亚硝酸钠、氯化钠、硝酸铝、1，1⁃二苯基⁃2⁃三硝基苯肼（1，1⁃diphenyl⁃2⁃picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′⁃联氮⁃二（3⁃乙基苯并噻唑啉⁃6⁃磺酸）二铵盐[2，2′⁃azino⁃bis（3⁃ethylbenzoth⁃iazoline⁃6⁃sulfonic acid）diamm⁃ onium salt，ABTS]、L⁃抗坏血酸、水杨酸、硫酸亚铁、过硫酸钾：上海麦克林生化科技有限公司；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、无水乙醇：天津市大茂化学试剂厂；细胞计数试剂盒（cell counting kit⁃8，CCK⁃8）：东仁化学科技（上海）有限公司。试验所用水均为超纯水，所用试剂均为分析纯。

大肠杆菌（Escherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）：佛山市中医院检验科。

人肝癌细胞（SMMC⁃7721，HepG2）、人神经胶质瘤细胞（U251）、人乳腺癌细胞（MCF⁃7，MDA⁃MB⁃231）、人结肠癌细胞（HCT⁃116）、人结直肠腺癌上皮细胞（DLD⁃1）、人恶性黑色素瘤细胞（A375）：中国科学院上海细胞库。

旋转蒸发仪（YRE⁃2000B）：巩义市予华仪器有限责任公司；万分之一分析天平（JJ224BC）：常熟市双杰测试仪器厂；数显恒温水浴锅（HH⁃4）：上海亚荣生化仪器厂；紫外分光光度仪（UV⁃2700）：日本岛津公司；超声波仪（JP⁃040S）：深圳市洁盟清洗设备有限公司；智能生化培养箱（LRH⁃150）：郑州生元仪器有限公司；酶标仪（EPOCH）：美国BioTek 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

干燥鸡蛋花100 g 置于45 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎后过60 目筛，用6 倍量95%乙醇回流提取3 次，减压浓缩得到总提取物。用水将总提取物混悬后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，分别减压回收溶剂、干燥至恒重得到石油醚萃取物（2.3 g）、氯仿萃取物（1.8 g）、乙酸乙酯萃取物（1.5 g）、水层（5.2 g）。

1.2.2 样品总酚含量测定

标准曲线的绘制参照文献[21]，采用福林⁃酚比色法测定总酚含量。配制浓度为2、4、6、8、10 µg/mL 没食子酸标准溶液，分别精密量取各标准溶液0.1 mL 置于5 支试管中，加入0.5 mL 福林酚试剂和7.9 mL 水，反应5 min 后，加1.5 mL 的1 g/L 碳酸钠溶液，避光放置2 h 后于765 nm 处测定吸光值。得到回归方程为y=0.077x+0.007 4，R2=0.999 7。鸡蛋花不同溶剂萃取物溶液按上述方法处理后测定吸光值，根据回归方程计算总酚含量，结果以每克干萃取物中毫克没食子酸当量（gallic acid equivalents，GAE）表示（mg GAE/g）。

1.2.3 样品总黄酮含量测定

采用三氯化铝分光光度法[19]测定总黄酮含量。精密称取12.5 mg 芦丁标准品于50 mL 容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，得到浓度为0.25 mg/mL 的标准溶液。使用移液管移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 标准品溶液分别置于10 mL 容量瓶中，分别依次加入2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL 无水乙醇，再依次加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀后放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，混匀后放置6 min，加入4 mL 10%氢氧化钠溶液，混匀后放置6 min，最后加入80%乙醇溶液定容至刻度，摇匀放置15 min。用紫外分光光度仪于510 nm处测定吸光值，制作标准曲线，得到回归方程为y=1.169 6x-0.014 3，R2=0.999 3。鸡蛋花不同溶剂萃取物溶液按上述方法处理后测定吸光值，根据回归方程计算总黄酮含量，总黄酮含量以每克干萃取物中毫克芦丁当量（rutin equivalents，RE）表示（mg RE/g）。

1.2.4 抑菌活性测试

最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的测定采用微量肉汤稀释法[22]。将鸡蛋花不同极性萃取物用营养肉汤培养液稀释至1 mg/mL。无菌环境下，在96 孔板第1 孔加入1 mg/mL 不同极性萃取物200µL，2～12 孔分别加入100µL 营养肉汤培养液，从第1 孔吸取100µL 提取液至第2 孔，混匀后从中吸取100µL 到第3 孔，依此类推，对萃取物进行倍比稀释，直至第10 孔，第10 孔吸取100 µL 弃去，使1～10孔浓度分别为1、0.5、0.25……0.003 906 25、0.001 953 125 mg/mL，从1～11 孔依次加入用营养肉汤培养液稀释1 000 倍的0.5 麦氏菌液100µL，以第11 孔为阳性对照观察细菌的生长状况，第12 孔补充100µL 营养肉汤培养液作为阴性对照以观察孔内是否被污染，最终保持每孔液体体积为200µL。将96 孔板密封置于恒温培养箱中37 ℃孵育20 h。最终以肉眼观察到孔内澄清、不发生浑浊、沉淀的最小药物浓度即为MIC。

1.2.5 体外抗氧化活性测定

1.2.5.1 DPPH 自由基清除能力测定

参考文献[23]方法，将150µL 0.1 mmol/L DPPH 溶液与50µL 不同浓度（1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 µg/mL）鸡蛋花不同极性萃取物供试液置于96 孔板相同微孔充分混合，并在25 ℃避光条件下放置30 min，在517 nm 处测定吸光值。用等浓度的VC溶液作为阳性对照，根据下式计算鸡蛋花不同极性萃取物对DPPH 自由基的清除率。

X=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：X为DPPH 自由基清除率，%；A0为等体积无水乙醇代替样品的空白对照组的吸光值；A1为试验组吸光值；A2为用等体积的无水乙醇代替DPPH 溶液的试验对照组的吸光值。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除能力测定

根据Tang 等[24]方法配制ABTS 工作液：7 mmol/L ABTS 溶液与4.95 mmol/L 过硫酸钾溶液（1∶1，体积比）混合，避光孵育12 h。将混合物用磷酸盐缓冲液（phos⁃phate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH7.4）稀释，使其在波长为734 nm 的条件下测定吸光值为0.70±0.02。150 µL ABTS 工作液与50 µL 不同浓度（1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 µg/mL）的鸡蛋花不同极性萃取物供试液置于96 孔板相同微孔充分混合并在25 ℃避光条件下放置30 min，然后在734 nm 处测定吸光值。用等浓度的VC溶液作为阳性对照，根据下式计算鸡蛋花不同极性萃取物对ABTS+自由基的清除率。

Y=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：Y为ABTS+自由基清除率，%；A0为等体积无水乙醇代替样品的空白对照组的吸光值；A1为试验组吸光值；A2为用等体积的无水乙醇代替ABTS 工作液的试验对照组的吸光值。

1.2.5.3 羟自由基清除能力测定

参考王迦琦等[25]的反应体系模型：预先制备9.0 mmol/L FeSO4溶液、不同浓度（1 000、500、250，125、62.5、31.25、15.625 µg/mL）鸡蛋花不同极性萃取物供试液、9.0 mmol/L 水杨酸⁃乙醇溶液和8.8 mmol/L 30%H2O2溶液。将上述溶液分别吸取50 µL 依次加入96 孔板相同微孔中充分均匀，25 ℃静置30 min 后，在510 nm 处测定吸光值。用等浓度的VC溶液作为阳性对照，根据下式计算鸡蛋花不同极性萃取物对羟自由基的清除率。

P=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：P为羟自由基清除率，%；A0为等体积无水乙醇代替样品的空白对照组的吸光值；A1为试验组吸光值；A2为用等体积的无水乙醇代替H2O2的试验对照组的吸光值。

1.2.6 体外抗肿瘤活性测试

1.2.6.1 细胞培养

细胞培养参照文献[26]。各细胞分别保存在含有10% 胎牛血清（fetal calf serum，FBS）和1% 青霉素/链霉素（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）的培养基中，并在37 ℃、5%CO2条件下保存。

1.2.6.2 体外抗肿瘤活性测定

参考Liu 等[27]方法，采用CCK⁃8 法测定不同浓度的鸡蛋花不同极性萃取物对肿瘤细胞的抑制作用。人肝癌细胞（SMMC⁃7721，HepG2）、人神经胶质瘤细胞（U251）、人乳腺癌细胞（MCF⁃7，MDA⁃MB⁃231）、人结肠癌细胞（HCT⁃116）、人结直肠腺癌上皮细胞（DLD⁃1）、人恶性黑色素瘤细胞（A375）分别接种于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时，加入6 个质量浓度（0、3、10、30、100、300µg/mL）的鸡蛋花不同极性萃取物供试液，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养48 h。培养结束后，每孔再加入10 µL CCK8 溶液，37 ℃继续孵育2 h，低速振荡30 s，使用酶标仪检测细胞在450 nm 处吸光值，计算细胞存活率（C，%）。

C=[（A1-A0）/（A2-A0）]×100

式中：A0为等体积含10%FBS 的培养基代替样品的空白对照组的吸光值；A1为试验组吸光值；A2为二甲基亚砜处理过的细胞的试验对照组的吸光值。

1.3 数据处理

所有试验均平行操作3 次，试验结果均表示为平均值±标准差，数据采用GraphPad Prism 5 软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 鸡蛋花不同溶剂萃取物中总酚和总黄酮含量

鸡蛋花不同溶剂萃取物总酚和总黄酮含量见表1。

表1 鸡蛋花不同溶剂萃取物总酚和总黄酮含量Table 1 Total phenols and total flavonoids in different solvent ex⁃tracts of Plumeria rubra L.

由表1 可知，鸡蛋花4 种不同溶剂萃取物中总酚含量的排序为乙酸乙酯＞水＞氯仿＞石油醚，表明鸡蛋花中水溶性多酚含量多于脂溶性多酚，在进行鸡蛋花多酚提取时应选择极性较大的溶剂。不同溶剂萃取物中总黄酮含量的排序为乙酸乙酯＞氯仿＞水＞石油醚。乙酸乙酯萃取物中总黄酮含量最高，石油醚、水和氯仿萃取物中总黄酮的含量均较低。综上，乙酸乙酯部位中总酚与总黄酮的含量均较高，在富集鸡蛋花总酚与总黄酮时，可选择乙酸乙酯作为萃取溶剂。

2.2 鸡蛋花不同溶剂萃取物抗菌效果

鸡蛋花不同溶剂萃取物对不同菌的抑菌作用如表2所示。

表2 鸡蛋花不同溶剂萃取物对不同细菌的MICTable 2 MIC of different solvent extracts of Plumeria rubra L.against different bacteria

由表2 可知，石油醚萃取物、氯仿萃取物对5 种菌的MIC 均大于1 mg/mL，乙酸乙酯萃取物和水层萃取物对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的MIC 为0.5 mg/mL外，对其余3 种菌的MIC 均为1 mg/mL。由此表明，乙酸乙酯萃取物和水层萃取物在体外对大肠杆菌和铜绿假单胞菌有较好的抑制作用。

2.3 鸡蛋花不同溶剂萃取物体外抗氧化效果

鸡蛋花不同极性萃取物和VC对DPPH 自由基、ABTS+自由基和羟自由基的清除效果见图1～图3。

图1 鸡蛋花不同溶剂萃取物对DPPH 自由基的清除率Fig.1 Scavenging of DPPH free radical by different solvent ex⁃tracts of Plumeria rubra L.

图2 鸡蛋花不同溶剂萃取物对ABTS+自由基的清除率Fig.2 Scavenging of ABTS+free radical by different solvent ex⁃tracts of Plumeria rubra L.

由图1～图3 可知，在浓度为15.625～1 000 µg/mL内，4 种不同极性鸡蛋花萃取物随着浓度的增加，对DPPH 自由基、ABTS+自由基和羟自由基清除率也逐渐递增。当浓度超过500 µg/mL 时，除石油醚萃取物对DPPH 自由基、ABTS+自由基的清除率的增长速度并未减弱外，其余清除率增长速度明显变缓。

IC50是评价抗氧化性的重要指标，抗氧化能力越强，其IC50越小。鸡蛋花不同极性萃取物抗氧化活性的IC50见表3。

表3 鸡蛋花不同极性萃取物抗氧化活性的IC50 值Table 3 IC50 of antioxidant activity by different solvent extracts of Plumeria rubra L.

由表3 可知，VC和鸡蛋花4 种不同极性萃取物清除DPPH 自由基和ABTS+自由基能力由大到小均依次为VC＞乙酸乙酯＞氯仿＞水＞石油醚，清除羟自由基的能力由大到小依次为石油醚＞VC＞乙酸乙酯＞氯仿＞水。综上，鸡蛋花4 种不同极性萃取物中乙酸乙酯萃取物抗氧化效果最为显著。当浓度达到1 000µg/mL，DPPH自由基、ABTS+自由基和羟自由基清除率分别达到93.32%、95.70%、62.86%，其IC50值分别为14.94、15.43、74.61µg/mL。

2.4 鸡蛋花不同溶剂萃取物体外抗肿瘤效果

鸡蛋花不同溶剂萃取物对肿瘤细胞的抑制作用见图4～图11。

图4 鸡蛋花不同溶剂萃取物对SMMC⁃7721 生长抑制曲线Fig.4 Growth inhibition curves of SMMC⁃7721 by different sol⁃vent extracts of Plumeria rubra L.

图5 鸡蛋花不同溶剂萃取物对HepG2 生长抑制曲线Fig.5 Growth inhibition curves of HepG2 by different solvent ex⁃tracts of Plumeria rubra L.

图6 鸡蛋花不同溶剂萃取物对MDA⁃MB⁃231 生长抑制曲线Fig.6 Growth inhibition curves of MDA⁃MB⁃231 by different sol⁃vent extracts of Plumeria rubra L.

图7 鸡蛋花不同溶剂萃取物对MCF⁃7 生长抑制曲线Fig.7 Growth inhibition curves of MCF⁃7 by different solvent ex⁃tracts of Plumeria rubra L.

图8 鸡蛋花不同溶剂萃取物对DLD1 生长抑制曲线Fig.8 Growth inhibition curves of DLD1 by different solvent ex⁃tracts of Plumeria rubra L.

图9 鸡蛋花不同溶剂萃取物对HCT116 生长抑制曲线Fig.9 Growth inhibition curves of HCT116 by different solvent extracts of Plumeria rubra L.

图10 鸡蛋花不同溶剂萃取物对A375 生长抑制曲线Fig.10 Growth inhibition curves of A375 by different solvent ex⁃tracts of Plumeria rubra L.

图11 鸡蛋花不同溶剂萃取物对U251 生长抑制曲线Fig.11 Growth inhibition curves of U251 by different solvent ex⁃tracts of Plumeria rubra L.

由图4～图11 可知，石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取物和水层在0～300µg/mL 浓度下对8 种细胞均有不同程度的抑制作用。随着药物浓度的升高，细胞的存活率也相应降低，表明鸡蛋花不同溶剂萃取物抑制肿瘤细胞的生长具有良好的剂量效应。其中氯仿萃取物对8 种肿瘤细胞的抑制作用最明显，其次为乙酸乙酯、石油醚和水层。当浓度达到300 µg/mL 时，氯仿萃取物对MCF⁃7 和U251 的抑制率接近100%。

鸡蛋花不同极性萃取物对应8 种肿瘤细胞的IC50值见表4。

表4 鸡蛋花不同极性萃取物对应8 种肿瘤细胞的IC50 值Table 4 IC50 of different solvent extracts of Plumeria rubra L.against eight tumor cells

从表4 可以看出，不同肿瘤细胞对鸡蛋花不同溶剂萃取物的敏感性均不同。氯仿萃取物对MDA⁃MB⁃231、A375 和HCT⁃116 的抑制作用较强，其IC50值分别为9.12、10.39、14.72µg/mL；乙酸乙酯萃取物对A375 的抑制作用最强，IC50值为29.76 µg/mL；石油醚萃取物对MDA⁃MB⁃231 的抑制作用最强，IC50值为75.38µg/mL；水层对各细胞48 h 的IC50值均大于300µg/mL。

3 讨论与结论

本研究对鸡蛋花95% 乙醇提取物不同极性萃取部位的总酚、总黄酮含量以及生物活性如体外抗菌、抗氧化、抗肿瘤进行分析。结果表明，在4 种极性萃取组分中，乙酸乙酯萃取物中总酚和总黄酮的含量最高，分别为（57.73±0.09）mg GAE/g、（558.88±0.99）mg RE/g。4 种极性萃取组分具有广谱抑菌性和较强的抗氧化能力，而乙酸乙酯萃取物的抗菌、抗氧化效果最强。乙酸乙酯萃取物对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的MIC 为0.5 mg/mL，对其余3 种菌的MIC 为1 mg/mL。乙酸乙酯萃取物对DPPH 自由基、ABTS+自由基和羟自由基清除率分别高达93.32%、95.70%和62.86%，其抗氧化性几乎能与VC媲美，因此可认为鸡蛋花是天然的强抗氧化剂。综上，鸡蛋花的抗菌、抗氧化活性成分集中在乙酸乙酯极性部位，而该部位总酚和总黄酮的含量最高，且在一定质量浓度范围内，其抗菌、抗氧化能力的大小和浓度之间存在明显的量效关系。上述结论表明总酚与总黄酮含量与鸡蛋花抗菌活性和抗氧化活性有较好的相关性，为了更好地研究鸡蛋花多酚和黄酮类物质的抗菌、抗氧化性机制，可利用紫外分光光度计、高效液相色谱仪等对鸡蛋花乙酸乙酯萃取物进一步的研究与分析。

而此次体外抗肿瘤活性实验结果表明，石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取物和水层在0～300 µg/mL 浓度条件下对人肝癌细胞（SMMC⁃7721，HepG2)、人乳腺癌细胞（MDA⁃MB⁃231，MCF⁃7)、人结肠癌细胞（HCT⁃116)、人结直肠腺癌上皮细胞（DLD⁃1)、人恶性黑色素瘤细胞（A375)、人神经胶质瘤细胞（U251)8 种细胞均有不同程度抑制作用。其中氯仿萃取物对8 种肿瘤细胞的抑制作用最明显，其IC50值分别为18.78、30.68、9.12、23.89、14.72、40.14、10.39、23.50 µg/mL。然而，氯仿萃取物所含总酚与总黄酮并不是最高，这表明总酚与总黄酮含量与抗肿瘤活性作用可能相关性小。在相应研究中，鸡蛋花氯仿萃取物除了多酚和黄酮物质外，还存在其他的多种化学成分，其对肿瘤细胞的抑制作用是否与多酚、黄酮含量相关，仍有待进一步对鸡蛋花氯仿萃取物的成分进行研究。因此，通过深入研究鸡蛋花氯仿部位的具体成分，确定其具有抗肿瘤活性的化学物质，对于开发鸡蛋花为天然的药物制剂具有重要意义。

本文从药效学角度考察了鸡蛋花不同极性部位具有的多种生物活性，而且由于鸡蛋花易于收集，成本相对较低，因此将鸡蛋花开发成为食品、保健品或者药品的前景广阔，可进行深入研究。