何氏育麟方治疗卵巢储备功能下降作用机制的网络药理学和分子对接研究

王如烨 章 勤 方晓红

卵巢储备功能下降（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢中剩余卵母细胞数量减少、质量下降，生育能力下降、性激素缺乏等[1]，可进展为卵巢早衰，并出现一系列围绝经期症状，对女性远期心脑血管等健康造成威胁。目前对于DOR 的临床治疗主要运用激素替代治疗、脱氢表雄酮、抗氧化剂补充等，但不能从根源上改善DOR 患者的卵巢功能，且有一定的副作用[2]。近年来，中医药在治疗DOR 方面研究颇多。一项系统评价和荟萃分析发现，运用补肾调肝法治疗DOR，可以有效改善患者生殖激素水平与窦卵泡数量[3]。何氏育麟方源于浙江省非物质文化遗产——浙江何氏妇科，全方由《济阴纲目》苁蓉菟丝丸化裁而成，包含菟丝子、覆盆子、枸杞子、当归、川芎、熟地黄、巴戟天、肉苁蓉、仙灵脾和蛇床子十味中药。前期研究发现，何氏育麟方可改善DOR 患者月经周期与激素水平，改善卵巢功能，但其作用的具体机制鲜有深入研究[4-5]。因此，本研究利用网络药理学和分子对接的方法，对何氏育麟方治疗DOR 的相关靶点、信号通路加以分析，以期从药物-靶点-机制层面为治疗DOR 提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 获取何氏育麟方药物相关靶点 通过中药系统药理学数据库（TCM systems pharmacology，TCMSP），分别以菟丝子、枸杞子、当归、川芎、熟地黄、巴戟天、肉苁蓉、仙灵脾、蛇床子和覆盆子为检索词，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 为筛选条件，获取以上各味中药的活性成分和潜在作用靶点。

1.2 获取DOR 疾病相关靶点 通过人类基因数据库（Genecards）和人类孟德尔遗传数据库（OMIM）获取DOR 的潜在靶点，检索词为“ovarian reserve hypofunction”，同时限定搜索范围为“Homo sapiens”，合并所有获得的靶点，并去除重复靶点。

1.3 构建“药物-化合物-靶点”网络图 将何氏育麟方中的有效成分和DOR 中的潜在靶点整理后输入Cytoscape 3.9.0 软件，构建可视化“药物-化合物-靶点”网络图，通过软件的分析模块对网络图进行分析，以度值为筛选指标，筛选出网络图中的核心节点。其中度值的高低代表节点连线的多少，度值越高，其重要性越高。

1.4 构建蛋白互作网络图 利用疾病和药物的共有靶点在String 数据库中获取蛋白互作连线网络文件，导入Cytoscape 3.9.0 软件，通过软件的分析模块对网络图进行分析。此外，使用CytoNCA 软件通过接近中心度（closeness centrality，CC），介值中心度（betweenness centrality，BC） 和度值中心度（degree centrality，DC）筛选出关键靶点，BC、CC 和DC 应≥中位数。将这些靶点作为何氏育麟方治疗DOR 的核心靶点，并构建蛋白互作网络图。

1.5 通路和功能富集分析 将1.4 中筛选出来的核心靶点输入DAVID 数据库进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto encyclopedia of genes genomes，KEGG）富集分析，物种选择为“homo sapiens”。通过R 软件中的“Pathview”包和KEGG 通路富集分析对靶点进行统计分析和可视化，结果以校正P＜0.05 作为筛选条件。筛选出何氏育麟方治疗DOR 所涉及的主要生物学过程和有显著性差异的信号通路。

1.6 分子对接 从PubChem 数据库中确定化合物名称、分子量和3D 结构，在RCS PDB 数据库中下载活性成分所对应的3D 结构。然后利用AutoDock Vina 软件，准备分子对接所需的配体和蛋白质，对目标蛋白晶体结构进行去除水分子、加氢、修饰氨基酸、优化能量和调整力场参数等预处理，将靶点结构与活性成分结构进行分子对接，利用AutoDock Vina软件进行对接，最后取每个蛋白结合能最低的结果作图，并使用Pymol 软件对其进行可视化。

2 结 果

2.1 何氏育麟方的活性成分和潜在靶点 检索各个数据库，合并删除重复成分，通过查阅文献整理出何氏育麟方中各味中药的重要活性成分共85 个，其中部分活性成分来源于多味中药。随后，从TCMSP 数据库中检索到何氏育麟方的1222 个潜在靶点，去除重复的靶点后，11 味中药共获得266 个潜在作用靶点。

2.2 何氏育麟方与DOR 的共有靶点 通过检索GeneCards 和OMIM 数据库，合并去除重复后共获得1376 个疾病靶点。将266 个药物靶点和1376 个疾病靶点输入到venny 2.1.0，最终获得136 个共有靶点。疾病和药物共有靶点韦恩图见图1。

2.3 何氏育麟方改善卵巢功能“疾病-药物-活性成分-靶点”网络图 我们利用Cytoscape 3.9.0 软件构建了药物-成分-靶点网络，明确了活性成分、潜在靶点和DOR 之间的联系（见图2）。表1 列出何氏育麟方治疗DOR 的十大关键活性成分。排名前5 的活性成 分 分 别 是 槲 皮 素（MOL000098）、 山 奈 酚（MOL000422）、β-谷甾醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）和木犀草素（MOL000006）。

图1 何氏育麟方和卵巢储备功能下降交叉靶点的韦恩图

2.4 何氏育麟方改善卵巢功能核心靶点筛选 将疾病与药物共有靶点导入STRING 数据库，得到共有靶点蛋白之间相互作用的连线网络文件，将网络文件导入Cytoscape 软件（Version3.9.0），得到一个包含88 个节点和716 条相互作用连线的网络图。之后使用CytoNCA 功能设置BC、CC 和DC＞2 倍中位数，以得到核心蛋白。第一步，DC≥13。第二步，BC、CC 和DC 分别≥40、0.428 和26（见图3）。因此，鉴定出15个与DOR 密切相关的核心蛋白，排名前5 的分别为TP53、MAPK1、TNF、AKT1 和ESR1，见图4。

2.5 GO 和KEGG 富集分析 基于何氏育麟方可能的靶点，运用GO 和KEGG 功能富集分析以探讨何氏育麟方调节DOR 的潜在信号通路或生物过程。GO 富集分析主要包括三个方面，包括生物学过程（biological process，BP）、细胞学组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。GO富集分析中BP 主要出现在细胞增殖及调控、细胞迁移、细胞凋亡等方面。CC 主要富集在膜阀、囊泡腔、转录调节复合物等。MF 主要富集在细胞因子受体结合、DNA 结合转录因子结合、激酶结合和蛋白激酶活性等。选取BP、CC 和MF 的前10 条目进行可视化。见图5A。

KEGG 富集分析发现了与关键靶点相连的代表性通路，包括癌症通路、PI3K/AKT、AGE-RAGE、HIF-1、NF-κB 和IL-17 信号通路等见图5B。

表1 何氏育麟方治疗卵巢储备功能下降的十大关键活性成分

图2 药物-化合物-靶点网络

图3 蛋白互作网络与疾病靶点的聚类分析流程图

图4 核心靶点网络图

2.6 分子对接结果 分别选取排名前5 的核心化合物和关键靶点（TP53、MAPK1、TNF、AKT1 和ESR1）进行分子对接。共进行受体与配体对接25 次，其中20 组结合能≤-3 kcal/mol，约占80%；11 组结合能≤-4.5 kcal/mol，约占44%。对接结果表明，选取活性成分与靶点结合活性良好。活性成分与靶点的结合热能见表2。每个蛋白和活性成分结合能最低的分子对接模式图见图6A～E。

3 讨 论

中医学中并无“卵巢储备功能下降”一词，但结合其临床表现，可归属于中医“月经过少”“月经先期”“月经后期”“闭经”“不孕”等范畴。其中《傅青主女科》中所提及的“年未老而经水断”的表现与本病最为相似。纵观古今，许多医家论及此病，其病因病机多由禀赋不足、后天失养、久病劳损、情志失调等导致肾精不足、天癸不生、冲任失调所致，并伴有肝郁、脾虚、血瘀等证[6]。病位在于胞宫冲任，兼顾肝脾肾三脏，病性以虚为主，兼见虚实夹杂，而虚多实少为常。治法总以补肾益气、充养天癸为大法，并随证而治，兼顾健脾益气、疏肝理气、活血化瘀等。何氏育麟方为浙江何氏妇科历经五代传承结晶，多用于肾虚型不孕症等疾病中，方中菟丝子味辛而甘，善补肾精，温而不燥；覆盆子酸温入肾，收摄耗散之阴气而蓄养阴精，二者相配，寓阳中求阴，阳中求阴，以子补子之意，共为君药；巴戟天、肉苁蓉、仙灵脾为臣，补肝肾益精血；当归、川芎、熟地黄、枸杞子养血调血，动静结合，补而不滞；蛇床子益肾壮阳。诸药相伍，以滋补肾精为核心，阴阳同补，佐以养精血，血充精足，则胞宫得以温养，临床上常可获不俗疗效。为促进中药复方作用机制的可视化、证据化的研究与发展，本研究采用网络药理学方法和分子对接技术，系统分析了何氏育麟方治疗DOR 的潜在机制。

图5 使用GO 和KEGG 数据库进行功能研究

表2 活性成分与靶点的结合热能（kcal/mol）

通过网络药理学分析，最终得到何氏育麟方活性成分主要有槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇和木犀草素等，来源于何氏育麟方中的十味中药，其中有的活性成分来源于多味中药，可见中药具有多成分、多靶点及其相互配伍、共同发挥作用的特点。槲皮素、山奈酚和木犀草素均属于类黄酮化合物，类黄酮被认为具有抗炎、抗氧化和抗诱变作用[7]。多项研究证实，槲皮素可通过增加卵巢颗粒细胞线粒体活性，降低细胞凋亡率、抑制氧化应激与炎症反应、从而改善卵巢功能[8-9]。山奈酚可以通过PI3K/AKT 信号通路促进原始卵泡活化，并减少体外培养的绵羊前窦卵泡DNA 碎片化[10]。卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡在促进卵泡发育功能、卵母细胞的成熟以及合成和分泌相关生殖激素等方面具有重要作用。木犀草素可以通过影响cAMP 信号通路及影响细胞中与雌二醇合成有关的芳香酶来促进卵巢颗粒细胞对雌二醇的合成及分泌[11]。β-谷甾醇可通过PI3K/AKT 信号通路促进卵巢颗粒细胞增殖，抑制细胞凋亡[12]。蛋白互作结果显示，TP53、MAPK1、TNF、AKT1 和ESR1 是该网络的核心靶点，通过对核心靶点进行GO 富集分析，结果表明这些核心靶点主要参与细胞增殖与调控、细胞凋亡、细胞迁移、DNA 复制、蛋白激酶调节等过程。TP53 基因家族被认为是人类生殖相关关键过程的调节者，其在维持卵泡池的大小等方面起着至关重要的作用，影响卵母细胞质量[13]。MAPK1 作用于卵巢颗粒细胞，在卵母细胞成熟中起关键作用[14]。TNF 作为一类细胞因子，其中TNF-α 的作用受到广泛关注。有研究发现，TNF-α 参与卵泡发育、甾体生成、排卵和黄体功能等生理过程的调节，同时可以调节颗粒细胞的分化[15]。AKT1 被证实参与了卵巢细胞内代谢、凋亡、细胞周期或细胞骨架动力学的调节[16]，AKT1 的缺乏可以表现出生育能力降低和动情周期异常，卵巢中原始卵泡减少[17]。ESR1被认为是治疗卵巢功能下降的候选基因，因雌激素调节了由ESR1编码的雌激素受体-α（ER-α）在下丘脑-垂体-卵巢轴处的循环促性腺激素的释放，与卵泡生成的调控关系密切[18]。由此可见，何氏育麟方的主要活性成分不仅参与了细胞氧化应激、细胞凋亡、细胞增殖等生物学过程，同时参与了患者生殖激素、卵巢生理过程的调控，以此发挥改善卵巢功能的作用。

图6 何氏育麟方改善卵巢功能核心成分与关键靶点分子对接图

进一步对核心靶点进行KEGG 富集分析，主要富集在癌症信号通路、PI3K/AKT 信号通路、AGE/RAGE 信号通路。虽然关键基因多富集于癌症信号通路中，但它是一个复杂的信号通路，包含PI3K 信号通路、ERK 信号通路等。而PI3K/AKT 信号通路作为富集度第二的通路，参与了多种生物学过程，是经典的线粒体凋亡途径，也是调节细胞的增殖、生长和凋亡重要的信号通路[19]。其中何氏育麟方中如山奈酚、β-谷甾醇等活性成分皆被发现通过该通路抑制颗粒细胞凋亡，从而改善卵巢功能，可猜想PI3K/AKT 信号通路在何氏育麟方改善DOR 中起到了关键作用[10，12]。IL-17 信号通路在炎症反应中具有关键作用[20]。而炎症反应影响排卵前卵泡中的类固醇产生细胞，特别是内部和外部膜层、黄体和颗粒细胞[21]，从而对卵巢功能产生影响。最后，我们使用分子对接技术将何氏育麟方的前5 位活性成分和前5 个关键蛋白进行分子对接，共进行受体与配体对接25 次，其中20 组结合能≤-3 kcal/mol，约占80%；11 组结合能≤-4.5 kcal/mol，约占44%。对接结果表明，选取活性成分与靶点结合活性良好，验证了本研究结果的准确性。

4 结 论

本研究通过网络药理学和分子对接技术，从多个方面对何氏育麟方治疗DOR 的作用机制进行了分析，揭示了何氏育麟方改善卵巢功能可能的信号通路和潜在的作用靶点，为临床治疗DOR 用药提供了一定的参考，也为进一步深入研究提供了理论依据，但鉴于研究方法的局限性，在后续需要一定的验证。