炙甘草汤通过miR-181a-5p 靶向SPHK2 调控心肌纤维化改善糖尿病心肌病

王天宇 丁君灿 程心怡 胡鹏飞

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病心血管系统的独立并发症，全球每年超400万人死于糖尿病，其中DCM 死亡人数占比50%～80%[1]，给社会带来沉重负担。目前，临床上尚无有效的特异性治疗方法。近年来，中药在治疗DCM 方面具有疗效独特和毒副作用小等优势，广泛受到国内外关注[2]。因此，探讨中药改善DCM 的机制具有一定的应用价值。中药传统方剂炙甘草汤源自汉代张仲景《伤寒论》，主治病证的病位在心，以补阴为主[3]。炙甘草汤能显著改善DCM 患者心功能，缓解临床症状，提高患者生活质量，且无明显不良反应[4]。据文献报道，炙甘草汤的主要成分为麦冬总皂苷、人参总皂苷和甘草酸，具有改善DCM 患者心功能的作用[5]。本研究建立了DCM 大鼠模型用于探究炙甘草汤对心肌成纤维细胞的作用，并深入分析炙甘草汤在DCM中的药理调控机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 7～8 周龄、体质量160～180 g 雄性Sprague Dawley（SD）大鼠30 只；出生3～5 d、体质量5～10 g SD 大鼠乳鼠10 只，购自杭州医学院实验动物中心，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0002，使用许可证号：SYXK（浙）2019-0011。所有大鼠均饲养于清洁级动物房内（温度18～25 ℃，相对湿度60%～70%），自动控制光照/黑暗交替（12 h/12 h），雄性SD大鼠在动物中心饲喂大鼠标准饲料1 周以适应环境。本实验已获得浙江省实验动物中心实验动物福利伦理委员会批准（伦理批号：ZJCLA-IACUC-20030098）。

1.2 药物与试剂 炙甘草汤由炙甘草12 g，生姜、桂枝各9 g，人参6 g，生地50 g，阿胶（后烊化）6 g，麦冬、麻仁各10 g，大枣10 枚组成，药材均购于浙江中医药大学附属第二医院中药房。链脲佐菌素（STZ，批号S8050）、柠檬酸钠缓冲液（批号C1013）、4%多聚甲醛（批号P1110）、HE 染色试剂盒（批号G1120）、Masson 染色试剂盒（批号G1340）、BCA 试剂盒（批号PC0020）、M-MLV 逆转录酶（批号RP1100）、细胞计数试剂盒8（CCK-8）试剂盒（批号CA1210）和双荧光素酶报告基因检测试剂盒（批号D0011）购于北京Solarbio 公司；miRNA 逆转录试剂盒（批号B532451）、实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）试剂盒（批号B639278）和引物购于上海生工生物工程有限公司；波形蛋白（Vimentin，批号46173SF）、α-SMA（批号19245T）、Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）（批号81375SF）、Ⅲ型胶原蛋白（CollagenⅢ）（批号98908SF）、鞘氨醇激酶2（SPHK2）（批号32346S）、β-actin（批号3700T）和IgG/HRP（批号7074S）购于美国Cell Signaling Technology 公司；miRNA-NC、miR-181a-5p 模拟物和miR-181a-5p 拮抗剂由上海GenePharma 公司设计。

1.3 主要仪器 实时荧光定量PCR 仪（德国罗氏公司，型号LightCycler 96）；倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司，型号AI09）；石蜡组织切片机（德国Leica 公司，型号RM2125）；化学发光仪（上海勤翔公司，型号610020-9Q）；酶标仪（美国热电公司，型号MK3）。

2 实验方法

2.1 分组与DCM 大鼠模型制备 雄性SD 大鼠30只，10 只大鼠作为对照组；20 只通过高糖高脂饮食联合腹腔注射STZ 构建DCM 大鼠模型，造模后按随机数字表法分成DCM 组、炙甘草汤组。对照组给予正常饮食，DCM 组和炙甘草汤组给予高糖高脂饮食4 周后，单次腹腔注射STZ（40 mg/kg）诱导建立糖尿病模型并于注射后7 d 测定空腹血糖（FBG），FBG≥16.7 mmol/L 视为Ⅱ型糖尿病模型造模成功。至STZ注射后8 周按分组进行灌胃给药，炙甘草汤组每日给予2 mL/100 g 炙甘草汤（1 g/mL）灌胃，DCM 组和对照组大鼠每日给予相同体积的生理盐水灌胃，连续4 周，每天1 次。灌胃给药结束后对照组大鼠全部存活，DCM 组大鼠存活6 只，炙甘草汤组大鼠存活7只，每组各选取6 只大鼠进行后续实验。

2.2 HE 染色 大鼠心脏经4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋制成4 μm 心肌组织切片。经二甲苯脱蜡和梯度乙醇复水后进行HE 染色，再通过梯度乙醇、二甲苯脱水和中性树脂胶封片。最后在显微镜下观察并拍照。

2.3 Masson 染色 大鼠的心肌组织石蜡切片通过二甲苯脱蜡和梯度乙醇复水后，铁苏木素染液染色10 min、Masson 复合染液染色5 min、丽春红染色5 min、磷钼酸溶液洗2 min 和苯胺蓝染液染色2 min。最后在显微镜下观察并收集图片。

2.4 心肌成纤维细胞分离、分组及药物处理 取出生3～5 d 的SD 大鼠乳鼠，75%乙醇灭菌2 次，无菌条件下取心脏组织，剪碎。用0.08%胰蛋白酶（含0.06%胶原酶Ⅰ）在37 ℃水浴中消化15 min。加入等量的含20%胎牛血清的DMEM 培养基终止消化后取上清，在37 ℃的恒温环境下重复5～10 次。以900 r/min离心10 min 弃除上清，收集细胞，重悬细胞。用细胞筛过滤后取上层清液，将过滤后的细胞再次离心后重悬，将重悬后的细胞置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中，1.5～2 h 后换液，贴壁的即为心肌成纤维细胞。通过免疫荧光检测Vimentin 的表达鉴定心肌成纤维细胞。将细胞分为以下几组：对照组（5.5 mmol/L葡萄糖），高糖组（30 mmol/L 葡萄糖），炙甘草汤组（1 g/mL 炙甘草汤预处理心肌成纤维细胞1 h，高糖诱导），miRNA-NC 组（转染miRNA-NC），miR-181a-5p 模拟物组（转染miR-181a-5p 模拟物），miR-181a-5p 拮抗剂组（转染miR-181a-5p 拮抗剂），炙甘草汤+miRNA-NC 组（转染miRNA-NC，1 g/mL 炙甘草汤预处理心肌成纤维细胞1 h，高糖诱导），炙甘草汤+miR-181a-5p 拮抗剂组（转染miR-181a-5p 拮抗剂，1g/mL 炙甘草汤预处理心肌成纤维细胞1 h，高糖诱导）。

2.5 免疫荧光染色 心肌成纤维细胞在室温下用4%多聚甲醛固定30 min，0.3% Triton X-100 通透15 min，BSA 溶液封闭1 h。将心肌成纤维细胞与一抗Vimentin（1∶200）在4 ℃下孵育过夜。与兔抗鼠荧光二抗（1∶150）孵育1 h，PBS 清洗后DAPI 染核。最后，通过荧光显微镜收集图像。

2.6 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 裂解液处理大鼠心肌组织和心肌成纤维细胞，使用BCA 试剂盒进行蛋白质定量，蛋白质通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离并转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭，一抗（1∶1000）在4 ℃下孵育过夜。膜与二抗（1∶2000）在37 ℃下孵育60 min，并通过ECL 显色获得蛋白条带。

2.7 qRT-PCR 检测 提取大鼠心肌组织和心肌成纤维细胞的总RNA，利用miRNA 逆转录酶和MMLV 逆转录酶（Promega）逆转录成cDNA。通过荧光定量PCR 试剂盒进行qRT-PCR。引物如下：miR-181a-5p 正向：5′-CGAACATTCAACGCTGTCG-3′，反向：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；CollagenⅠ正向：5′-GTGCAGTCGGTGCTCCAG-3′，反向：5′-TTCTCCTTTGCCTCCAGGTATG-3′；CollagenⅢ正向：5′-CCTCTCTTATTTTGGCACAGCA-3′，反向：5′-TGACATGGTTCTGGCTTCCA-3′；U6 正向：5′-CGCAAGGATGACACGCAAAT-3′，反向：5′-GTGCA-GGGTCCGAGGTATTC-3′；β-actin 正向：5′-CCCATCTACGAGGGCTATGC-3′，反向：5′-TTTGATGTCACGCACGATTTC-3′。

2.8 CCK-8 检测细胞活力 心肌成纤维细胞接种到96 孔板（3×103个/孔）中培养24 h。每孔加入CCK-8 溶液在37 ℃下培养2 h。使用酶标仪在450 nm 处检测心肌成纤维细胞的吸光度（OD 值），实验进行3次重复。

2.9 双荧光素酶报告基因实验检测 将SPHK2 基因3′UTR 序列的野生型（WT-SPHK2） 和突变型（MT-SPHK2）克隆到基因载体pmirGLO 中，构建野生型和突变型的双荧光素酶报告质粒载体。用双荧光素酶报告基因实验检测试剂盒检测心肌成纤维细胞WT-SPHK2 和MT-SPHK2 荧光素酶活性。

2.10 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示。两组间比较，方差齐性者采用两独立样本t 检验，方差不齐者采用Kruskal-Wallis H 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 DCM 大鼠模型构建 大鼠FBG 检测结果表明，与对照组比较，DCM 组大鼠FBG 水平显著升高[（30.40±3.48）mmol/L 比（5.08±0.17）mmol/L，P＜0.01]。HE 染色结果表明，对照组心肌细胞排列整齐、结构清晰，可见少量成纤维细胞；DCM 组大鼠心肌细胞肥大、排列紊乱、成纤维细胞增生伴炎症细胞浸润。以上结果表明，DCM 大鼠模型构建成功，见图1。

图1 大鼠心肌组织HE 染色（×200）

3.2 炙甘草汤改善DCM 模型大鼠心肌纤维化 大鼠心肌组织HE 染色结果表明，与DCM 组大鼠比较，炙甘草汤组心肌组织的病理改变得到了改善。Masson 染色观察心肌纤维化发现，对照组大鼠心肌细胞之间有少量胶原纤维，而DCM 组大鼠心肌间质胶原纤维明显增多且排列紊乱；炙甘草汤组大鼠的心肌纤维化程度改善。Western blot 结果表明，与对照组比较，DCM 组大鼠心肌组织中α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ和SPHK2 的表达升高；与DCM 组比较，炙甘草汤组α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ和SPHK2 的表达降低（见图2）。同时发现，与对照组比较，DCM 组大鼠心肌组织miR-181a-5p 表达水平显著降低（P＜0.01）；与DCM 组比较，炙甘草汤组miR-181a-5p 的表达水平显著升高（P＜0.05），见表1。

3.3 炙甘草汤改善高糖诱导的心肌成纤维细胞纤维化 CCK-8 检测发现，与对照组比较，高糖组心肌成纤维细胞的细胞活力显著升高（P＜0.01）；与高糖组比较，炙甘草汤组心肌成纤维细胞的细胞活力显著降低（P＜0.01）（见表2）。qRT-PCR 检测表明，与对照组比较，高糖组的心肌成纤维细胞中CollagenⅠ、CollagenⅢ水平显著升高（P＜0.01），miR-181a-5p 水平显著下降（P＜0.01）；与高糖组比较，炙甘草汤组心肌成纤维细胞中CollagenⅠ、CollagenⅢ表达显著降低（P＜0.01），miR-181a-5p 表达显著升高（P＜0.01）（见表3～4）。Western blot 检测发现，与对照组比较，高糖组心肌成纤维细胞中α-SMA、SPHK2 的表达升高；与高糖组比较，炙甘草汤组α-SMA、SPHK2 的表达降低，见图3。

3.4 miR-181a-5p 直接调控SPHK2 qRT-PCR 检测表明，与miRNA-NC 比较，心肌成纤维细胞转染miR-181a-5p 模拟物后miR-181a-5p 表达显著上调（P＜0.01），而转染miR-181a-5p 拮抗剂后miR-181a-5p 表达显著下调（P＜0.01）（见表5）。通过TargetScan 数据库分析发现，miR-181a-5p 与SPHK2 的3'UTR 存在结合序列（见图4）。双荧光素酶报告基因实验发现，miR-181a-5p 模拟物显著降低了WTSPHK2 荧光素酶活性（P＜0.01），而对MT-SPHK2 荧光素酶活性无影响（见表6）。Western blot 检测表明，与miRNA-NC 比较，心肌成纤维细胞转染miR-181a-5p 模拟物后SPHK2 蛋白表达降低，而转染miR-181a-5p 拮抗剂后SPHK2 蛋白表达升高，见图5。

3.5 炙甘草汤通过miR-181a-5p 调控高糖诱导的心肌成纤维细胞纤维化 qRT-PCR 检测发现，与高糖组比较，炙甘草汤组CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平显著降低（P＜0.01），miR-181a-5p 表达水平显著升高（P＜0.01）；与炙甘草汤+miRNA-NC 组比较，炙甘草汤+miR-181a-5p 拮抗剂组CollagenⅠ、CollagenⅢ表达水平显著升高（P＜0.01），miR-181a-5p 表达水平显著降低（P＜0.01）（见表7～8）；CCK-8 检测表明，与高糖组比较，炙甘草汤组心肌成纤维细胞的细胞活力显著降低（P＜0.01）；与炙甘草汤+miRNA-NC 组比较，炙甘草汤+miR-181a-5p 拮抗剂组心肌成纤维细胞的细胞活力显著升高（P＜0.01）（见表9）。Western blot 检测发现，与高糖组比较，炙甘草汤组α-SMA、SPHK2 表达降低，与炙甘草汤+miRNA-NC 组比较，炙甘草汤+miR-181a-5p 拮抗剂组α-SMA、SPHK2 表达升高，见图6。

4 讨 论

DCM 是糖尿病的一种慢性复杂并发症，其主要病理变化为心肌间质纤维化，从而降低心室顺应性，导致心脏舒张与收缩功能障碍，最终引发心力衰竭[6]。中医认为心主血脉，消渴病经久不愈会持续耗气伤阴以致气阴两伤，而炙甘草汤具有益气养阴、通阳复脉之功[7]。已有研究报道，炙甘草汤在纤维化的发生发展过程中发挥重要调节作用，例如炙甘草汤通过调节核因子-κB 信号通路改善异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化大鼠心功能[8]；炙甘草汤通过参与氧化应激，抑制成纤维细胞活化减轻博莱霉素诱导的小鼠特发性肺纤维化[9]。本研究结果显示，炙甘草汤可显著抑制DCM 大鼠心肌纤维化，表明了炙甘草汤对DCM 心肌损伤的良好治疗效果。

图2 炙甘草汤改善DCM 大鼠心肌纤维化

表1 炙甘草汤对DCM 大鼠心肌组织miR-181a-5p 表达的影响（±s）

表1 炙甘草汤对DCM 大鼠心肌组织miR-181a-5p 表达的影响（±s）

注：对照组与DCM 组均灌胃2 mL/100 g 的生理盐水；炙甘草汤组灌胃2 mL/100 g 浓度为1 g/mL 的炙甘草汤；DCM 为糖尿病心肌病；与对照组比较，aP＜0.01；与DCM 组比较，bP＜0.05

组别对照组DCM 组炙甘草汤组孔数333 miR-181a-5p 1.00±0.12 0.45±0.20a 0.72±0.18b

表2 炙甘草汤对心肌成纤维细胞活力的影响（%，±s）

表2 炙甘草汤对心肌成纤维细胞活力的影响（%，±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与高糖组比较，bP＜0.01

组别对照组高糖组炙甘草汤组孔数333细胞活力100.00±11.00 194.03±25.59a 147.63±25.80b

表3 炙甘草汤对心肌成纤维细胞纤维化的影响（±s）

表3 炙甘草汤对心肌成纤维细胞纤维化的影响（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与高糖组比较，bP＜0.01

组别对照组高糖组炙甘草汤组孔数333 CollagenⅠ1.00±0.17 3.73±0.81a 1.91±0.58b CollagenⅢ1.00±0.24 3.93±0.97a 2.02±0.45b

表4 qRT-PCR 检测炙甘草汤对心肌成纤维细胞miR-181a-5p 表达的影响（±s）

表4 qRT-PCR 检测炙甘草汤对心肌成纤维细胞miR-181a-5p 表达的影响（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与高糖组比较，bP＜0.01

组别对照组高糖组炙甘草汤组孔数333 miR-181a-5p 1.00±0.21 0.41±0.18a 0.69±0.17b

图3 Western blot 检测心肌成纤维细胞中α-SMA 和SPHK2蛋白表达

表5 过表达和抑制miR-181a-5p 后心肌成纤维细胞中miR-181a-5p 的表达（±s）

表5 过表达和抑制miR-181a-5p 后心肌成纤维细胞中miR-181a-5p 的表达（±s）

注：与miRNA-NC 组比较，aP＜0.01

组别miRNA-NC 组miR-181a-5p 模拟物组miR-181a-5p 拮抗剂组孔数333 miR-181a-5p 1.00±0.28 2.82±0.86a 0.29±0.09a

图4 TargetScan 数据库预测SPHK2 与miR-181a-5p 的结合位点

表6 miR-181a-5p 与SPHK2 的靶向结合关系（±s）

表6 miR-181a-5p 与SPHK2 的靶向结合关系（±s）

注：SPHK2 为鞘氨醇激酶2；与miRNA-NC＋WT-SPHK2 组比较，aP＜0.01

组别miRNA-NC＋WT-SPHK2 组miR-181a-5p 模拟物＋WT-SPHK2 组miRNA-NC＋MT-SPHK2 组miR-181a-5p 模拟物＋MT-SPHK2 组孔数3333荧光素酶活性1.02±1.05 0.41±0.02a 1.04±0.13 0.99±0.15

图5 Western blot 检测心肌成纤维细胞中SPHK2 蛋白表达

表7 抑制miR-181a-5p 对心肌成纤维细胞纤维化的影响（±s）

表7 抑制miR-181a-5p 对心肌成纤维细胞纤维化的影响（±s）

注：与高糖组比较，aP＜0.01；与炙甘草汤＋miRNA-NC 组比较，bP＜0.01

组别高糖组炙甘草汤组炙甘草汤＋miRNA-NC 组炙甘草汤＋miR-181a-5p 拮抗剂组孔数3333 CollagenⅠ3.84±0.71 1.93±0.54a 1.89±0.26 2.95±0.67b CollagenⅢ3.94±0.74 2.04±0.65a 1.85±0.63 2.99±0.74b

表8 抑制miR-181a-5p 对心肌成纤维细胞中miR-181a-5p 表达的影响（±s）

表8 抑制miR-181a-5p 对心肌成纤维细胞中miR-181a-5p 表达的影响（±s）

注：与高糖组比较，aP＜0.01；与炙甘草汤＋miRNA-NC 组比较，bP＜0.01

组别高糖组炙甘草汤组炙甘草汤＋miRNA-NC 组炙甘草汤＋miR-181a-5p 拮抗剂组孔数3333 miR-181a-5p 1.00±0.18 2.94±0.74a 2.89±0.57 0.77±0.17b

表9 抑制miR-181a-5p 对心肌成纤维细胞活力的影响（%，±s）

表9 抑制miR-181a-5p 对心肌成纤维细胞活力的影响（%，±s）

注：与高糖组比较，aP＜0.01；与炙甘草汤＋miRNA-NC 组比较，bP＜0.01

组别高糖组炙甘草汤组炙甘草汤＋miRNA-NC 组炙甘草汤＋miR-181a-5p 拮抗剂组孔数3333细胞活力100.00±21.81 59.17±8.35a 59.75±8.08 78.57±10.64b

图6 Western blot 检测心肌成纤维细胞中α-SMA 和SPHK2蛋白表达

miRNA 通过抑制mRNA 翻译或与mRNA 的3'UTR 结合负调控其表达，参与许多心血管疾病发展[10]。例如，miR-34a 可以通过靶向Pin-1 信号降低CollagenⅠ的生成并增加心脏成纤维细胞的凋亡，从而减轻DCM 心肌纤维化[11]。miR-181a-5p 是一种多功能miRNA，在许多生理和病理过程中发挥重要调节作用。一项研究发现，miR-181a-5p 通过靶向内啡肽抑制肿瘤坏死因子-α 刺激的炎症从而改善肺动脉高压症状[12]。LncRNA KCNQ1OT1 通过靶向miR-181a-5p增加PDCD4 的表达，促进DCM 心肌细胞凋亡[13]。我们研究发现，DCM 组大鼠心肌组织miR-181a-5p 表达水平显著低于对照组，而经过炙甘草汤处理后miR-181a-5p 表达水平上升，提示miR-181a-5p 可能是炙甘草汤的潜在作用靶点。随后的细胞实验表明，miR-181a-5p 在高糖诱导的心肌成纤维细胞中表达下调，在此基础上经炙甘草汤预处理后表达水平上升，再次证实了我们的推测。

通过TargetScan 数据库分析发现，miR-181a-5p与SPHK2 的3'UTR 存在结合序列并通过双荧光素酶报告基因实验得到进一步证实。SPHK2 是一种多功能脂质激酶，定位于多个细胞器，调节多种重要的分子机制[14]。有证据显示，在肾脏纤维化的小鼠模型中抑制或删除SPHK2 可以减少炎症和纤维化反应，从而减轻肾损伤[15-16]。然而SPHK2 在DCM 心肌纤维化中的机制缺乏文献报道，有待深入研究。本实验结果显示，SPHK2 蛋白在高糖诱导的心肌成纤维细胞中表达上升，在此基础上转染miR-181a-5p 模拟物后表达下降，转染miR-181a-5p 拮抗剂后表达上升。在动物实验中，SPHK2 蛋白在DCM 大鼠心肌组织中显著上调而经炙甘草汤处理后表达量下降，这与细胞实验的结果一致。

综上所述，炙甘草汤具有改善DCM 的作用，其作用机制可能是通过miR-181a-5p 靶向SPHK2 调控心肌纤维化来实现的。