尿沉渣中钙信号相关mRNA 作为IgA 肾病足细胞损伤无创性指标的研究

刘 翔 汤绚丽 余 瑾

IgA 肾病（IgA nephropathy，IgAN）是目前最常见的原发性慢性肾小球疾病，5%～25%的IgAN 患者10年内进展为终末期肾脏病（end-stage renal disease，ESRD），需行肾脏替代治疗[1]。近年来，足细胞在IgAN中，致病作用受到更多关注，足细胞损伤与蛋白尿及IgAN 病情进展正相关[2]。传统的免疫荧光染色技术测定尿足细胞，因受染色费时，依赖培训的个人技术等限制，阳性率及准确性大大下降。随着对尿足细胞生物标志物研究的深入，监测尿沉渣中mRNA 和蛋白质被认为是量化足细胞损害的工具。在体内外研究中发现，钙依赖的经典瞬时受体电位阳离子通道蛋白（transient receptor potential canonical，TRPC）6 介导钙依赖的足细胞损伤，尿钙蛋白酶（Calpain）活性亦能反映足细胞的损伤，并证实单体汉防己甲素可以通过干预TRPC6 介导的钙依赖信号途径改善足细胞损伤[3-4]。本实验通过提取IgAN 患者予单体汉防己甲素治疗前后尿沉渣中钙信号相关mRNA 及细胞骨架相关锚定蛋白Talin-1、足细胞骨架蛋白synaptopodin mRNA，观察上述生物标志物能否实时反映该病变的动态演变。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015 年9 月至2017 年8 月杭州市中医院肾病科收治的经首次肾组织活检病理明确诊断为原发性IgAN 患者36 例为IgAN 组。选取同期常规体检正常（只尿液检查，不肾穿），无高血压、糖尿病及心肾疾病史的8 例我科医务人员建立健康对照组。本研究取得受试对象或其亲属知情同意，并通过浙江中医药大学附属杭州市中医院伦理委员会审批，伦理批号为2015KY035。

1.2 诊断标准 肾组织活检明确以IgA 沉积为主的系膜增生性肾小球肾炎，排除继发性IgAN，包括过敏性紫癜性肾炎、乙肝相关性肾炎、系统性红斑狼疮等。

1.3 纳入及排除标准 纳入标准：（1）原发性IgAN患者且肾活检病理光镜下小球数＞10 个。（2）有完整肾活检病理及临床资料。（3）年龄在18～60 岁之间。排除标准：（1）合并有心、脑、肺、肝、造血系统等严重系统性疾病，恶性肿瘤患者；（2）排除各种急慢性感染，例如肺部感染、慢性阻塞性肺疾病、泌尿系感染、活动性结核、慢性病毒性肝炎等，或肾移植术后者。

1.4 方 法 选取其中12 例IgAN 患者（1 g/24 h≤蛋白尿≤3 g/24 h，及血肌酐≤264 μmol/L）进行治疗，口服汉防己甲素（规格20 mg，浙江康恩贝生物制药公司）40 mg 每天3 次，治疗时间2 个月。

1.5 观察指标

1.5.1 临床指标 收集肾活检时患者的年龄、性别、病程、平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）、血白蛋白（albumin，Alb）、血肌酐（serum creatine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）等，尿检包括尿常规红细胞计数、24 h 尿蛋白定量。并根据24 h尿蛋白定量的严重程度进行半定量分级，＜0.5 g，评分为0；0.5～＜1 g，评分为1；1～＜3 g，评分为2；≥3 g，评分为3。其中MAP 定义为舒张压+1/3 脉压差。eGFR 采用慢性肾脏病流行病学合作研究（Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration，CKD-EPI）公式计算[5]。GFR=a×（血肌酐浓度/b）c×（0.993）年龄；a 值女性=144，男性=141；b 值女性=0.7，男性=0.9；c 值女性：血清肌酐≤0.7 mg/dL=-0.329，＞0.7 mg/dL=-1.209；男性血清肌酐≤0.7 mg/dL=-0.411，＞0.7 mg/dL=-1.209。

1.5.2 肾脏病理 所有肾活检标本常规处理，免疫荧光，光镜及电镜检查。参照牛津MEST-C 评分对病理进行评分[6]。并将镜下足细胞损伤按照足突融合的程度分为4 个等级（小部分融合：足突融合≤25%；部分融合：25%＜足突融合≤50%；大部分融合：50%＜足突融合≤75%；广泛融合：足突融合＞75%）。

1.5.3 免疫组织化学法测定TRPC6 进行免疫组化半定量分析，每例患者的切片中至少观察5 个完整的肾小球，利用Image Pro Plus 6.0 图像分析软件进行分析，测定每个肾小球中TRPC6 阳性面积占其整个肾小球面积的比，取平均值作为此标本中肾小球TRPC6 阳性面积所占的比值。

1.5.4 尿足细胞荧光测定 采用晨尿标本50 mL，离心后弃上清，留沉渣混匀，间接免疫荧光法测定足细胞表达，高倍镜下确认足细胞、摄像、计算机储存。然后选择左上、左下、右上、右下和中间，5 个不同部位，共计20 个高倍视野，记录下荧光显示呈（+++）且形态相对完整的足细胞数。

1.5.5 尿沉渣中钙依赖的足细胞相关蛋白TRPC6以及Calpain、骨架蛋白Talin-1、synaptopodin mRNA测定 同一份晨尿标本20 mL，1 h 内处理，离心后弃去上清，留取尿沉渣，采用Trizol 法对尿沉渣的总RNA 进行提取，并完成质量检测。提取细胞总RNA，PrimeScriptTMRTMaster 逆转录为cDNA。使用Power－SYBRGreen 进行qRT-PCR 检测。使用2-ΔΔCt方法归一化目的基因的表达。本研究所用引物由上海生工公司设计及合成。引物序列如下：TRPC6 F：5'-AGTTCCTTGTGGTCCTTGCTGTTG-3'，R：5'-GAAGGAGGCTGCGTGTGCTAC-3'；Calpain-1 F：5'-CGAACTTCATGCGGGAGTTCAC-3'，R：5'-GTGCCTTCGTAGAGTGTGGTGTTC-3'；Talin-1 F：5'-CTGGTACTGCGTCTGTGGTGAAC-3'，R：5'-GGTTGGAGGAGATTGTGGTGACTG-3'；synaptopodin F：5'-GCCCAAACCCAACCAGAACCTC-3'，R：5'-CTGGCGTGTGGCTTGAAGACTC-3'；Nephrin F：5'-CCCCAACATCGACTTCACTT-3'；R：5'-GGCAGGAVATCCRTGAG-3'；GAPDHF：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'；R：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。

1.6 统计学方法 应用SPSS 23.0 软件包，计量资料方差齐性以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两独立样本t 检验，治疗前后比较采用配对t 检验；方差不齐用中位数及四分位数表示，用Mann-Whitney 非参数检验结果。计数资料以例数和/或百分数表示，两组间比较采用卡方检验。多组间比较，采用Kruskal-Wallis 秩和检验。运用Spearman rank方法分析各目的基因表达量与临床指标间的关联性。构建受试者工作特征（ROC）曲线评估各目的基因诊断的敏感度及特异度。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组研究对象一般资料比较 两组研究对象年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。IgAN 组高血压比例高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组研究对象一般资料比较

2.2 两组研究对象尿沉渣钙信号相关蛋白TRPC6以及Calpain、骨架蛋白Talin-1、synaptopodin 的mRNA 比较 两组研究对象尿沉渣中Calpain-1 mRNA 比较，IgAN 组较健康对照组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组间TRPC6、Talin-1 及synaptopodin mRNA 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 尿TRPC6 mRNA 与肾组织TRPC6 之间的关系

在正常肾组织中，肾小球脏层上皮细胞（足细胞）仅有少量TRPC6 表达或者不表达，TRPC6 在肾小管上皮细胞和间质的血管壁也有少量表达。IgAN 各组足细胞上的TRPC6 表达都增加。见图1。

不同水平的尿mRNA，其肾组织中TRPC6 的表达不同，与健康对照组0.05（0.02，0.08）相比，10≤尿TRPC6 mRNA＜100 组2.70（1.99，3.42），及尿TRPC6 mRNA≥100 组5.64（2.77，8.34）肾组织中TRPC6 阳性面积明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。10≤尿TRPC6 mRNA＜100 组相比于TRPC6 mRNA≥100 组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2 两组研究对象尿沉渣钙信号相关蛋白及骨架蛋白mRNA 比较

图1 不同组间肾小球TRPC6 免疫组化图（×400）

2.4 足细胞阴性与阳性组临床资料及尿mRNA 比较 两组患者病理上S 及T 的积分比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。两组患者尿mRNA 比较，足细胞阳性组较阴性组尿TRPC6 mRNA 及Calpain-1 mRNA 水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组患者一般资料中血肌酐、24 h 尿蛋白定量、血白蛋白、eGFR 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。2.5 尿液mRNA 水平与临床病理指标相关性分析尿TRPC6 mRNA 与Calpain mRNA 及synaptopodin mRNA 呈现正相关（r=0.626，P=0.001；r=0.734，P＜0.001），与Talin-1 mRNA 无相关性，尿Calpain mRNA 与synaptopodin mRNA 呈现正相关（r=0.626，P=0.001）。

尿TRPC6 mRNA 与蛋白尿分级水平呈现正相关（r=0.407，P=0.049），与足细胞融合的程度呈现正相关（r=0.452，P=0.027）。尿Calpain mRNA 与蛋白尿分级水平呈现正相关（r=0.493，P=0.014），与MAP 呈现正相关（r=0.469，P=0.021）。

2.6 ROC 曲线下面积分析 利用各项测得的尿mRNA 指标评估足细胞损伤（足突融合分级≥3），尿TRPC6 mRNA 预测足细胞损伤的曲线下面积（AUC）为0.705（P=0.048），敏感度和特异度为66.7%和33.3%（见图2），尿Calpain-1 mRNA 的AUC 为0.580，但P 值＞0.05（P=0.440），而尿synaptopodin mRNA、Talin-1 mRNA 的AUC 均＜0.05。见图2。

2.7 治疗前后临床指标及尿液mRNA 对照 与治疗前比较，治疗后24 h 尿蛋白定量减少，MAP 较前下降，相应的尿TRPC6 mRNA 及Calpain-1 mRNA水平较治疗前下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），尿足细胞阳性人数较治疗前减少，但差异无明显统计学意义（P＞0.05），尿Talin-1 mRNA 及synaptopodin mRNA 水平未见明显差异（P＞0.05）。见表4。

3 讨 论

IgAN 患者尿液中包含许多生物学信息，主要包括各种细胞因子、趋化因子、脱落细胞及其相关的mRNA 等。近10 年以来，研究和发掘尿中生物标志物，以期更好地诊断和评估IgAN，一直是国内外众多学者关注的焦点。

目前多种研究证实IgAN 存在足细胞损伤的机制，IgAN 患者血清中分离的IgA1 糖基化异常可诱导足细胞炎症反应和纤维化，分泌促炎性细胞因子，促进与IgAN 相关的炎症级联反应和肾纤维化变化[7]，并进而引起肾小球硬化[8]。因此监测、防治IgAN 足细胞损伤是治疗IgAN 的重要环节。

表3 足细胞阳性组与阴性组IgAN 患者临床资料及尿mRNA 比较

图2 受试者工作特征曲线下面积预测足细胞损伤

尿足细胞测定大多使用传统的免疫荧光染色技术进行相对计数，但受染色费时、检测员技术、尿液污染、清洗过程中丢失、去分化尿足细胞未被识别等限制，阳性率较低。与监测细胞及蛋白标志物相比，尿沉渣mRNA 或许更能作为慢性肾脏病的生物标志物。研究发现，NPHS1、TRPC6 等可通过异常表达导致蛋白尿性肾脏疾病的发生，synaptopodin、Talin-1等因其功能异常，导致足细胞功能和结构异常[9-10]。

TRPC6 阳离子通道开放能引起钙离子内流，介导钙相关的信号通路激活，导致足细胞骨架蛋白改变，引起细胞脱落凋亡，导致滤过屏障完整性丧失，产生大量蛋白尿[4]。在我们的研究中，相比较正常人群，IgAN 患者的尿液中TRPC6 mRNA 表达升高，且免疫组化亦证实尿中TRPC6 mRNA 升高可以在一定程度上反映肾组织中TRPC6 表达的水平。同时，与正常人群比较，IgAN 患者尿液中Calpain-1 表达升高，尿synaptopodin、Talin-1 mRNA 未见明显升高，可能与足细胞对相关分子的排泄不遵循一个均匀的模式及骨架蛋白上游影响因素多等原因相关。

我们将患者分为尿足细胞阴性及阳性组，足细胞阳性组的患者临床表现较重，表现为血肌酐及蛋白尿的升高，病理上S 及T 的积分重于足细胞阴性组，与此同时，尿足细胞阳性组其尿TRPC6 mRNA水平及Calpain-1 mRNA 表达高于足细胞阴性组，且尿足细胞钙信号相关mRNA 指标之间有着微妙的相关联系，表现为尿TRPC6 mRNA、Calpain mRNA、synaptopodin mRNA 三个指标呈现两两正相关，提示在IgAN 足细胞损伤的患者中，钙信号通路起了一定的作用，且能在尿中反映相应损伤。尤其是TRPC6 mRNA、Calpain-1 mRNA 从病理生理学角度来说，这两者之间联系更为密切。

上述尿足细胞相关mRNA 也可反映临床病理改变。尿TRPC6 mRNA、Calpain-1 mRNA 与IgAN 蛋白尿分级水平呈现正相关，尿TRPC6 mRNA 与电镜上的足细胞融合程度正相关。进一步利用ROC 曲线预测足细胞损伤，尿TRPC6 mRNA 反映IgAN 患者足细胞的损伤程度AUC 为0.705，敏感度和特异度为66.7%和33.3%，相比荧光尿足细胞阳性，更能反映足细胞融合程度。

既往对尿足细胞测定的研究多为断点研究，难以用于实时监测疾病动态演变及判断病情。由于汉防己甲素可作用于钙信号，保护足细胞，我们治疗干预后，重复测定上述尿mRNA 水平，以评价其是否可作为动态监测IgAN 足细胞损伤指标，及评价药物疗效的指标。12 例IgAN 患者治疗后，伴随24 h 尿蛋白定量减少和MAP 的下降，相应的尿TRPC6 mRNA及Calpain-1 mRNA 水平较治疗前下降，有一定的评价疗效的作用。但本次研究样本量少、随访观察时间短，且为开放式观察，有待于我们扩大样本量，延长治疗、随访时间，为尿TRPC6 mRNA 及Calpain-1 mRNA 作为评估IgAN 足细胞损伤及评价疗效的生物标记物提供更充分的证据。