水稻秸秆腐熟过程中理化性质及微生物群落变化

摘要：为进一步揭示秸秆腐熟过程中微生物群落的结构变化和理化性质变化的关系，对秸秆进行腐熟处理，对其不同时间的理化性质和微生物多样性进行分析。理化性质检测结果如下：在整个腐熟过程当中，秸秆中纤维素逐渐暴露，温度先上升后下降。pH值先下降后上升，E4/E6值在20 d时最低，30 d时最高，总碳含量和总氮含量一直处于下降趋势，秸秆中的碳氮比整体上处于上升趋势。生物可降解指数先上升至4.102后下降至3.840。电导率在40 d时上升至0.67 mS/cm。秸秆腐熟处于10 d和30 d时漆酶活性较高，分别达到0.96、0.98 U/mL。秸秆腐熟处于 40 d 时纤维素酶活性达到了0.04 U/mL。秸秆腐熟处于30 d时木聚糖酶活性达到了0.08 U/mL。苯基杆菌属（Phenylobacterium）的出现伴随着木聚糖酶活性增加，曲霉属（Aspergillus）丰度的变化与漆酶活性变化相似。功能预测结果表明，微生物群落包含纤维素、木质素、尿素、芳香化合物降解功能。微生物群落与环境因子的相关性分析解释了环境因子对于样本中物种组成的影响。本研究明确了秸秆腐熟中理化性状及发酵垛中微生物多样性的改变，并为以秸秆腐熟相关酶活性为指标筛选秸秆降解菌株提供理论依据。

关键词：水稻秸秆腐熟；理化性状；微生物多样性；功能预测；高通量测序

中图分类号：S5141.4；S182" 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）24-0241-08

收稿日期：2023-12-18

基金项目：国家自然科学基金（编号：31671796）。

作者简介：姜子豪（1999—），男，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，主要从事发酵工程研究。E-mail：920856119@qq.com。

通信作者：俞志敏，博士，副教授，主要从事啤酒酿造微生物、微生物代谢工程、糖生物学研究。E-mail：yuzhimin2005@163.com。

我国为农业大国，秸秆产量巨大，秸秆作为农作物的副产品，富含大量的有机物质以及矿物质。大部分秸秆都被焚烧或者弃置处理，不仅会对环境造成污染，还会对这部分资源造成极大的浪费。因此，如何绿色利用这种生物资源，是我国农业可持续发展面临的问题。

目前，我国的秸秆资源主要采用堆肥技术使其变废为宝，秸秆经过发酵，其中的有机物质被降解，一部分转化成可被微生物利用的营养物质，一部分转化成腐殖质增加土壤肥力。已有研究表明，在堆肥过程中，微生物的一系列生命代谢活动在秸秆降解过程中起到关键作用^［1］。其中微生物在不同腐熟时期所产生的酶是秸秆腐熟的重要因素，目前已有研究表明，秸秆腐熟过程中主要为纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶共同协作产生效果，许多研究者利用菌株是否产纤维素酶为指标筛选出产纤维素酶且酶活性较高的菌株作为秸秆腐熟的功能菌，将其加入到秸秆中加快腐熟进程，提高腐熟质量，目前，已被多数人认可。目前，发现的能够降解纤维素的细菌主要有芽孢杆菌属（Bacillus）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）和纤维弧菌属（Cellvibrio）等^［2］。向腐熟过程中接种某些微生物以增强微生物的腐熟作用会使腐熟更高效或获得更好的腐熟效果^［3］。王靖然等在蘑菇渣中以产纤维素酶和秸秆降解能力强为指标进行筛选，筛选出1株能在低温条件下具有降解秸秆能力的菌株mgz-5^［4］。可降解纤维素的真菌，包括根霉属（Rhizopus）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）和木霉属（Trichoderma）等。周海宾等研究发现，与自然腐熟相比，在秸秆堆肥开始阶段接种3%的黑曲霉，纤维素的降解率可提升1.36倍，表明黑曲霉在秸秆腐熟过程中加快了纤维素的降解^［5］。最新研究中发现，多种微生物具有较高的纤维素酶活性，可以促进秸秆腐熟，但菌株的功能表现出不稳定性且多为单一菌株^［1-5］。

为探究不同时期理化性质的变化与微生物群落变化的关系，本研究以秸秆为材料，对秸秆腐熟过程中的温度、腐熟指标、酶活性与微生物多样性进行测定，通过分析理化性质与微生物多样性之间的关系，揭示微生物在秸秆腐熟中的作用以及在这一过程中的生物降解机制。目前，大多数文献多以产纤维素酶的菌株为主要研究方向，产半纤维素、木质素降解相关酶的菌株鲜有人报道，本研究能够为以产纤维素酶、漆酶、木聚糖酶为指标筛选高效降解秸秆菌株的相关研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻秸秆取自庄河农场。

1.2 试验试剂

苯酚、硫酸、羧甲基纤维素钠、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠、葡萄糖、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸、亚硫酸氢钠、木糖、酒石酸、酒石酸钠、过氧化氢、硫酸汞、重铬酸钾、硼酸、盐酸、甲基红、溴甲酚蓝、乙醇，均购自天津市大茂化学试剂厂。藜芦醇、木聚糖、ABTS，均购自阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 试验仪器

小容量全温振荡培养箱（ZQZY-78C，知楚，上海）；电热鼓风干燥箱；紫外分光光度计（UV 5200，元析，上海）；可见光分光光度计（722S，精密，上海）；凯氏定氮仪（KDN816，纤检，上海）；消化炉（NYP308，纤检，上海）；pH计（PHS-3C，雷磁，上海）；热场发射扫描电子显微镜（JSM-7800F，日本电子，日本）；蒸汽灭菌器（SX-500，TOMY，日本）。

1.4 试验设计

对收割后的秸秆进行浸水处理，调整其含水量至60%～70%，进行堆垛（高50～70 cm），秸秆自然腐熟。秸秆腐熟时间为40 d，在秸秆腐熟进行20 d时进行翻垛处理并适量补充水分（试验于2023年7月10日至8月29日进行，试验地点为大连工业大学生物催化技术国家地方联合实验室）。

秸秆腐熟过程中，采取五点取样法，每隔10 d取发酵堆体顶部向下10 cm处秸秆，用于进行扩增子测序分析的样本于-80 ℃密封保存，40 d后统一送样测序；用于进行理化性质测定的试验样本，分为2个部分，一部分放入自封袋中4 ℃干燥避光保存，用于测定波长465 nm处吸光度/波长 665 nm 处吸光度（E4/E6）、pH值、电导率（EC）、可溶性糖含量、酶活性，另一部分自然风干后进行粉碎，过120目筛，4 ℃干燥避光保存，用于测定全氮含量、总有机碳含量和使用热发射场扫描电镜测定秸秆表面特征。

1.5 试验方法

1.5.1 理化性质的测定

从自封袋中称取10 g样品放入锥形瓶中并加入100 mL蒸馏水，将锥形瓶放入摇床中，200 r/min振荡30 min，将锥形瓶中混合物于8 000 r/min离心5 min后使用0.45 μm滤膜进行抽滤，滤液存放于50 mL离心管中4 ℃保存，用于测量pH值、E4/E6值、电导率、可溶性糖含量、酶活性。

温度：每10 d采用五点取样法对发酵垛进行测温，每个取样点由深至浅每5 cm进行1次测温并记录，并测定和记录环境温度。

pH值：用pH计测定滤液pH值并记录数据。

E4/E6值：将滤液加入到比色皿中用可见光分光光度计测量波长465 nm处的吸光度（E4）和波长665 nm处的吸光度（E6），计算E4/E6值。

电导率：用电导率笔测定滤液的电导率并记录数据。

可溶性糖（SC）含量：称取10 g样品放入锥形瓶中并加入80 ℃的蒸馏水100 mL，提取样品中的可溶性糖，充分浸提30 min后进行抽滤，取一部分滤液使用苯酚硫酸法测定可溶性糖含量^［6］。

酶活性：纤维素酶的活性采用NY/T 912—2020《饲料添加剂纤维素酶活力的测定 分光光度法》^［7］测定；木聚糖酶的活性采用DB13/T 1090—2009《饲料用酶制剂中木聚糖酶活力的测定——分光光度法》^［8］测定；漆酶的活性采用ABTS法^［9］测定。

总氮含量：称取0.5 g粉碎后的样品于消化管中，加入0.4 g CuSO4和6 g K2SO4，以不加样品为空白对照进行消化，消化后使用全自动凯氏定氮仪测定全氮含量。

总碳含量：参考土壤学大辞典^［10］测定。

总有机碳（TOC）含量：使用HJ 615—2011《土壤 有机碳的测定 重铬酸钾氧化-分光光度法》^［11］测定。

生物可降解指数（BI）取决于堆肥中总有机碳含量、可溶性糖含量以及堆肥天数。将总有机碳含量、可溶性糖含量以及堆肥天数（t）代入公式（1）计算BI。

BI=3.166+0.039TOC+0.832SC-0.011t。（1）

形态变化：称取0.5 g粉碎后的样品，使用扫描电镜每隔10 d观察其形态。

1.5.2 高通量测序

采用高通量测序方法对样品中微生物的多样性进行测定，基因组的提取和测序工作由上海天昊生物科技有限公司完成。

1.6 数据处理

本研究所有试验均进行至少3次重复，数据以平均值±标准差的形式呈现，本研究使用Microsoft Excel 2016进行数据统计，使用SPSS 16进行差异显著性分析（α=0.05），用Origin 2022进行绘图。

2 结果与分析

2.1 秸秆腐熟过程中的温度变化

由图1可知，在整个腐熟过程当中，环境最高温度为28 ℃，最低温度为17.7 ℃。发酵垛内最高温度为37.1 ℃，最低温度为21 ℃，整个腐熟过程中，温度先上升后下降，于30 d时达到腐熟最高温。

2.2 秸秆腐熟过程中的理化性质变化

2.2.1 pH值、E4/E6、总碳含量、总氮含量、碳氮比、生物可降解指数、电导率变化

堆肥过程中不同时期的pH值、E4/E6、总碳含量、总氮含量、碳氮比、生物可降解指数、电导率的动态变化见表1。可以看出，随着秸秆腐熟过程的进行，发酵垛pH值呈先下降后上升再下降的趋势，0～20 d，pH值先从7.14降低至6.82，后上升至7.51。秸秆腐熟初期pH值下降可能与有机质的不完全降解和氨挥发有关，随后，垛内微生物利用秸秆中含氮有机物产生NH3，使堆体pH值缓慢上升至微碱性^［12-13］。

E4/E6值在30 d时达到最高值11.56，而后下降至7.64。秸秆经过微生物降解后产生的一种亲水酸性物质被称为腐殖酸。它在秸秆腐熟产物有机质中扮演着重要的角色。腐殖酸被认为是一种复杂的混合物，由具有相似性质和芳香结构的酸性物质组成。腐殖酸分子含有多种活性官能团。从腐熟秸秆中浸提腐殖酸，通过测定浸提液中的 E4/E6 值可以用来评价腐殖酸分子中芳香环的芳构化程度、分子量和缩合程度等特性。浸提液中的 E4/E6 值越高则反映出秸秆腐熟物中腐殖酸聚合度越低，而E4/E6值越低则反映出腐殖酸聚合度越高。本试验中E4/E6值在20～40 d时上升后下降可能是翻垛所致，2次下降趋势表明腐殖酸单体聚合。

秸秆中的总碳含量一直下降，最终下降到48.61%。秸秆中的碳源被微生物所利用导致总碳含量降低。秸秆中的总氮含量也一直下降，最终下降到1.60%。由于氨气的挥发，导致总氮含量降低。随着腐熟的进行，秸秆中的碳氮比上升至30.381。碳氮比对微生物的生长代谢起着重要作用。在生物质发酵过程中，碳源和氮源被微生物所利用生成CO2、NH3、硝酸盐、亚硝酸盐以及腐殖质。因此，在生物质腐熟过程中，碳和氮的变化往往伴随着微生物群落的变化，总碳含量和总氮含量均呈下降趋势，由于微生物利用碳源和氮源的速率不同而导致碳氮比在腐熟过程中总体处于一个上升趋势，所以每个腐熟阶段的特征可以用碳氮比表示。腐熟堆肥理论上讲应趋于微生物菌体的碳氮比。

秸秆中的生物可降解指数先上升至4.102后下降至3.840。生物可降解指数是由堆体中的总有机碳含量、可溶性糖含量和堆体发酵天数综合评价的腐熟指标。生物可降解指数可以评价秸秆是否腐熟，有研究表明，生物可降解指数在2.9以上时秸秆未腐熟，腐熟的秸秆生物可降解指数在2以下^［14］。

滤液的电导率呈先上升后下降最后上升的趋势，40 d时上升至0.67 mS/cm。电导率可代表秸秆腐熟过程中垛体内固体所含可溶性盐的量，是评价秸秆腐熟产物进行堆肥是否会对植物产生毒害的一个重要指标，在一定程度上反映堆肥对植物的毒性以及对植物的生长抑制作用，电导率过大，堆料作为有机肥施用可能对土壤微生物活性产生不利影响，最终抑制作物生长。电导率的下降可能是因为微生物生长消耗堆料中的可溶性盐，发酵中期电导率上升可能是因为微生物活动过程中降解有机质产生更多的可溶性盐^［15-18］。

2.2.2 秸秆腐熟过程中漆酶、纤维素酶、木聚糖酶活性的变化

堆肥过程中不同时期酶活性的动态变化如图2、图3、图4所示。秸秆腐熟处于10、30 d时漆酶活性较高，分别达到0.96、0.98 U/mL。秸秆腐熟处于40 d时纤维素酶活性达到了最高值 0.04 U/mL。秸秆腐熟处于30 d时木聚糖酶活性达到了0.08 U/mL。作物秸秆主要由3种物质组成，即纤维素、半纤维素和木质素，占秸秆干重的80%以上，包含10%～25%木质素、20%～30%半纤维素和40%～50%纤维素，是植物细胞壁结构的主要成分。纤维素酶主要包括内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）、β-葡糖苷酶（BG），3种酶协同作用将纤维素分解为葡萄糖单体。半纤维素相对于纤维素，其聚合度小得多，可反应的官能团多，所以容易降解，主要通过β-1，4-外切木聚糖酶、β-1，4-内切木聚糖酶和β-木糖苷酶的协同作用降解。木聚糖则被β-1，4-外切木聚糖酶和β-1，4-内切木聚糖酶切割为聚合度较低的多糖，然后再被 β-木糖苷酶彻底降解。木质素降解酶主要包括以血红素糖蛋白为主的过氧化氢酶、锰过氧化物酶及以多酚氧化物为主的漆酶^［19-23］。

2.3 秸秆腐熟过程中的形态变化

使用热发射场扫描电镜对不同时间的秸秆腐熟物样品进行观察，秸秆腐熟过程中的形态变化如图5所示。0 d的秸秆中含有的木质素、纤维素被包含在蜡质层中，蜡质层表面光滑致密未被破坏；10 d的秸秆表面蜡质层开始分解，与0 d相比，秸秆表面出现微生物覆盖；进入20 d后，秸秆的表面蜡质层被破坏，被盖住的纤维逐渐显露出来；秸秆腐熟过程进入30 d时，秸秆中表面结构部分被破坏，出现残缺，纤维素较多裸露出来；对腐熟40 d的秸秆观察的结果显示，秸秆结构明显变得破碎。

2.4 秸秆腐熟过程中微生物群落分析

2.4.1 腐熟过程中细菌多样性分析

稀释度曲线如图6-a所示，可以看出，测序数据合理。由图 6-b 可知，有22种细菌在整个腐熟过程中都存在，在0、10、20、30、40 d时，特有的细菌物种分别为398、487、1 016、525、694种。所有细菌物种在属水平上的物种组成柱状图如图6-c所示。可以看出，0 d时假单胞菌属（Pseudomonas）和鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）的相对丰度较高，经历腐熟过程后，它们的相对丰度逐渐降低。10 d时出现寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas），研究表明，假黄色单胞菌属具有降解木质纤维素的途径；20 d时Ohtaekwangia为优势菌种；30 d出现噬几丁质菌属（Chitinophaga）。研究表明，Ohtaekwangia和噬几丁质菌属可抑制真菌生长，导致发酵垛内真菌微生物量降低^［24-25］。40 d 时根瘤菌属（Rhizobium）、小单胞菌属（Micromonospra）的丰度上升，苯基杆菌属（Phenylobaterium）的出现伴随着木聚酶活性增加。

2.4.2 腐熟过程中真菌多样性分析

由图7-a可知，稀释度曲线逐渐平稳，确定了测序数据可用。由图7-b可知，共检测到19种真菌在整个腐熟过程中都存在，0、10、20、30、40 d检测到特有的真菌菌种分别为127、105、88、216、103种。对秸秆腐熟的各个时期的真菌多样性进行监测（图7-c），0 d主要以红酵母属（Rhodotorula）和Papiliotrema为优势菌属；10 d的优势菌属为曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）和墨头菌属（Coprinopsis），曲霉素丰度变化与漆酶活性变化相似，研究表明，Fusarium在秸秆腐熟过程中可产生相关酶系加速秸秆腐熟过程；20 d出现丝葚霉属（Papulaspora）；30 d时，Iodophanus为优势菌属；40 d时，Ovatospora为优势菌属^［26］。

2.4.3 功能预测分析

由图8和图9可知，秸秆腐熟过程中的微生物与化学异养、需氧异养、硝酸盐还原相关，随着腐熟过程的进行，微生物纤维素、木质素、芳香化合物降解功能丰度增加，可能是由于假黄色单胞菌属、曲霉属菌株丰度增加导致。

2.4.4 微生物多样性与环境因子关联性分析

由图10可知，10、20、30、40 d的微生物群落与环境因子的相关性较大，说明10、20、30、40 d发酵垛中的细菌组成受温度、pH值、E4/E6、生物可降解指数、漆酶活性、纤维素酶活性、木聚糖酶活性、总碳含量、碳氮比、可溶性糖含量的影响。变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）丰度变化与pH值、E4/E6、漆酶活性、生物可降解指数呈正相关关系，浮霉菌门（Planctomycetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、绿弯菌门（Chloroflexi）丰度变化与木聚糖酶活性、碳氮比、温度和纤维素酶活性呈正相关关系。研究表明，Actinobacteria的丰度增加，能够产生纤维素酶从而促进秸秆降解。尽管这些细菌在发酵垛内丰度不高，但这些门水平的细菌丰度变化能够影响发酵垛内理化性质的变化。由图11可知，20、30、40 d的微生物群落与环境因子的相关性较大，说明20、30、40 d发酵垛中的细菌组成受温度、pH值、E4/E6、生物可降解指数、漆酶活性、纤维素酶活性、木聚糖酶活性、总碳含量、碳氮比的影响。子囊菌门（Ascomycota）丰度变化与漆酶活性、木聚糖酶活性、温度、生物可降解指数、碳氮比和纤维素酶活性呈正相关关系，研究表明，垛体内铵态氮的含量会影响Ascomycota丰度变化^［27］。

3 结论与讨论

降解秸秆的核心在于筛选出能高效降解木质纤维素的微生物，并在最佳环境下培养，使其成为优势菌群，产生大量相关酶系，共同完成秸秆降解。研究显示，真菌在降解木质素方面优于细菌和放线菌，但高温发酵可能降低其酶活性。因此，筛选出能稳定降解木质素且适应高温的菌种，有助于提高纤维素降解效果。王秀红等对玉米秸秆垛式堆肥不同翻堆时期的细菌菌群进行分析发现，嗜热脲芽孢杆菌属、高温单胞菌属和芽孢杆菌属在发酵前期丰度较高，而梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、Chryseolinea和假单胞菌属在发酵后期丰度较高。在秸秆腐熟的不同阶段，优势功能微生物的种类和功能呈现多样性。因此，通过应用高通量测序技术，可以明确堆肥在不同腐熟时期优势菌群的变化。这对于未来优化菌剂组合、提高腐熟效率具有关键意义^［28-30］。

本研究表明，在秸秆发酵过程中，一些丰度较高的菌属对秸秆腐熟过程没有贡献，而一些丰度较低的菌属如Pseudoxanthomonas、Aspergillus、Actinobacteria可以通过产酶降解秸秆，推动秸秆腐熟进程。功能预测结果表明，微生物群落包含纤维素分解功能、木质素分解功能、芳香化合物降解功能、尿素分解功能，与其相关的菌群可能产生纤维素酶、漆酶、木聚糖酶，并可能对腐熟过程中碳氮比有影响，可加快腐熟进程。本研究可为以纤维素酶、漆酶、木聚糖酶为指标筛选能够高效降解秸秆的菌株提供理论依据。

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