组织保护剂对病毒核酸与豚鼠皮肤组织样本RNA 的保存效果探究

李华，徐兰举，黄学亮，王亚如，刁立琴*，于月欣*

1.河北纳科生物科技有限公司，石家庄 050035；2.河北以岭医院，石家庄 050090；3.河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050227

在分子生物学实验与检测过程中，生物样本的保存对于检测结果的真实性和可重复性至关重要。储存后的生物材料应在分析前具有最小的变化，以便为研究人员提供高质量的样品，从而得出可靠以及可重复的实验或检测结果［1］。冷冻组织是目前现代生物学检测中最常用的生物样本，样本的冷冻储存和运输过程中通常会选择液氮作为储存剂［2］。液氮的低温特性是样本保存的理想条件，但其可能会导致接触者的活组织产生快速冻结现象。快速冻结现象被称为“低温烧伤”，会造成参与样品存储和检测的实验人员严重冻伤［3］。除液氮外，干冰也是进行生物样品低温运输的常用方式。但干冰同样存在易冻伤的危险，且其易升华，放置在普通密闭容器内有爆炸的危险。当大量使用干冰时，要保持环境的通风，防止大量气体挥发造成人员窒息。液氮和干冰的危险性质以及高昂的运输成本极大地限制了其常规使用［4］。此外，冷冻样品往往会导致生物样本细胞内外的冷冻损伤和渗透应激［5］。因此，探究易于实施、成本低廉且更安全的样品储存运输方式对生物样品的结果检测至关重要。

很多临床手术样本很难及时冻存到液氮或者干冰，甚至-80 ℃冰箱中，因此RNA 样本的采集、运输、保存及使用困难。RNA later是由Ambion公司研发的组织保护剂产品。RNA保护剂的问世解决了临床组织样品中RNA 极易降解的难题。本文研发了一种新配方的组织保护剂，探究了其对病毒核酸载量的保护效果，比较了其与市售RNA later产品以及常规储存方式对豚鼠皮肤组织样本RNA 提取量和纯度的影响，旨在为实验生物样品RNA的保存与运输提供一种安全简便的选择。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Hartley 豚鼠，SPF 级，250～350 g，雌雄各半，购自青岛康大爱博生物科技有限公司。许可证号：SCXK（鲁）2021 003。

1.2 主要试剂与仪器

组织保护剂属于本公司自研产品，其组成成分如下：在去离子水中，充分溶解40%硫酸铵、5%氯化钠、1 mg·L-1RNase 抑制剂混合液、0.1%DEPC 水。待所有试剂充分溶解后，使用有机酸（HCl 与H2SO4等量混合），调节溶液pH 至5.5～6.0。

实验涉及试剂：自研组织保护剂（河北纳科生物科技有限公司，210902）、市售RNA later（美国赛默飞公司，91226297）、RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司，DP419）、DEPC 水（北京索莱宝科技有限公司，R1600）、无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂，3852）、硫酸铵（美国Sigma-Aldrich公司，7783-20-2）、氯化钠（天津市永大化学试剂有限公司，7647-14-5）、RNase 抑制剂混合液（Thermo Fisher，Promega and New England Biolab，N8080119）、琼脂糖电泳Maker［生工生物工程（上海）股份有限公司，B600022-0050］、Super gelred（美国US EVERBRIGHT INC 公司，IS0429）、琼脂糖粉末（美国赛默飞公司，0000733422）、6×loading buffer（上海碧云天生物技术有限公司，D0071）、50×TAE 缓冲溶液（北京索莱宝科技有限公司，T1060）。

实验涉及仪器：NanoDrop×2000c 分光光度计（美国赛默飞公司）、4 ℃离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、琼脂糖电泳仪（美国Bio-rad公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 核酸病毒的病毒载量检测 本研究收集了20 例新型冠状病毒感染患者的核酸病毒，将其放入组织保护剂中。核酸病毒管在4 ℃、室温（25 ℃）和37 ℃放置不同时间后，送河北以岭医院检验科PCR 实验室检测。与初始核酸病毒载量相比较，核酸病毒放置不同时间后病毒载量的改变情况。本研究共设置以下分组：4 ℃条件下，保存0 d组、7 d组、14 d组、21 d组和30 d组；25 ℃条件下，保存0 d 组、1 d 组、3 d 组、5 d 组和7 d 组；37 ℃条件下，保存0 h组、6 h组、12 h组、18 h组和24 h组。

1.3.2 皮肤组织样本RNA 提取量、纯度和降解情况检测 本研究取豚鼠皮肤组织样本，放入液氮组、市售RNA later 液组和组织保护剂组中。3 个实验组的组织样本在4 ℃放置30 d、25 ℃放置7 d或37 ℃放置24 h 后，称量20 mg 豚鼠皮肤组织样本，检测不同保存方式在保存相同时间后组织样本RNA 的降解情况。使用组织研磨器在液氮中研磨组织块，然后按照RNA 提取试剂盒的步骤提取组织细胞RNA。提取RNA 后，进行RNA 提取量和纯度的检测。

本研究进一步利用1.2 %琼脂糖凝胶电泳进行RNA 降解情况的检测，各组取2.5 μL RNA 与0.5 μL 6×loading buffer 混合，进行琼脂糖凝胶电泳，观察RNA条带的情况。

1.3.3 统计方法 本研究中所有实验数据均使用SPSS 20.0 进行统计分析，使用均数±标准差表示。t检验进行组间数据的统计学分析，P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 核酸病毒载量的检测

合适的样本保存液能够保证病毒的检出率，避免发生漏检［6］。在4 ℃条件下，20 份新型冠状病毒样本分别保存0、7、14、21 和30 d 后，进行各组病毒核酸的提取，通过实时荧光PCR 检测病毒载量的变化，结果如表1所示，20份病毒样本的循环数（Ct）值分别放置0、7、14、21 和30 d 后，Ct值均在初始Ct值附近波动，各处理Ct值之间无统计学差异（P＞0.05），证实本组织保护剂在4 ℃条件下可以保存病毒30 d，对病毒核酸具有较好的保护效果。

表1 4 ℃放置不同时间后病毒核酸载量的比较Table 1 Comparison of viral nucleic acid load at 4 ℃ for different time

本研究同时检测了在25 ℃条件下，保存0、1、3、5和7 d后，Ct值的波动情况。如表2所示，与0 d组相比较，1 d 组、3 d 组、5 d 组和7 d 组的Ct值均无统计学差异（P＞0.05）。该结果表明，25 ℃条件下，组织保护剂可以保存病毒7 d。

表2 25 ℃放置不同时间后病毒核酸载量的比较Table 2 Comparison of viral nucleic acid load at 25 ℃ for different time

如表3所示，本研究检测了在37 ℃条件下，核酸病毒在保护剂中保存0、6、12、18和24 h后Ct值的变化情况。与0 h 组相比较，各实验组的Ct值均无统计学差异（P＞0.05）。该结果表明，在37 ℃的条件下，组织保护剂对病毒载量的保存效果可以长达24 h。

表3 37 ℃放置不同时间对病毒核酸载量的比较Table 3 Comparison of viral nucleic acid load at 37 ℃ for different time

2.2 皮肤组织样本的RNA检测

RNA 很容易被RNA 酶降解，因此需要一种高效、无害的方法来优化RNA 的保存和提取［7］。RNA 的浓度和纯度是进行RNA 样本质量评价的主要标准和进行后续研究的必要前提［8］。本研究取豚鼠的皮肤组织，放入液氮、市售RNA later 和组织保护剂中，市售RNA later 和组织保护剂组在4 ℃放置30 d 后，取20 mg 组织提取RNA，比较各组组织RNA 的提取量和纯度。如图1A 所示，组织保护剂保存样本的RNA 提取量与液氮保存或市售RNA later 保存无统计学差异（P＞0.05）。琼脂糖电泳凝胶结果显示，各组RNA 条带均存在28 S 和18 S 条带，且28 S 条带灰度值：18 S 条带灰度值＞1∶1，接近2∶1，说明各组所提RNA 的完整性好（图1B）。本研究检测了各组样本RNA 在A260/A280吸光度值、A260/A230吸光度值的改变。液氮组A260/A280吸光度均值为1.91、A260/A230吸光度均值为2.07；市售RNA later 组的A260/A280吸光度均值为1.93、A260/A230吸光度均值为2.06；组织保护剂组的A260/A280吸光度均值为1.96、A260/A230吸光度均值为2.07。如图1C～D 所示，各实验组RNA 的A260/A280吸光度值与A260/A230吸光度值之间无显著差异（P＞0.05）。

图1 4 ℃放置30 d后不同处理对RNA保护的验证结果Fig.1 Verification results of RNA protection by tissue protectant after 30 days at 4 ℃

图2 为豚鼠皮肤组织样本在25 ℃放置7 d 的结果。组织保护剂保存样本的RNA 提取量、A260/A280吸光度值和A260/A230吸光度值与液氮保存组或市售RNA later保存组无显著差异（P＞0.05）。

图2 25 ℃放置7 d后不同处理对RNA保护的验证结果Fig.2 Verification results of RNA protection by tissue protectant after 7 days at 25 ℃

本研究取豚鼠的皮肤组织在各实验组中37 ℃放置24 h 后，取20 mg 组织进行组织中RNA的提取。如图3 所示，与液氮保存组或市售RNA later 组相比较，组织保护剂保存样本的RNA 在提取量、纯度方面均无统计学差异（P＞0.05）。上述结果表明，本公司自研生产的组织保护剂与进口市售RNA later 具有相近的RNA 保护效果，可以作为其替代品应用。

图3 37 ℃放置24 h后不同处理对RNA保护的验证结果Fig.3 Verification results of RNA protection by tissue protectant after 24 hours at 37 ℃

3 讨论

随着我国生命科学领域的迅速发展，更多研究者开始注重生物资源的利用。此时，生物样本的质量对生物科学领域的研究愈发重要［9］。在医学研究中，生物样本是联系分子信息与疾病发现的桥梁［10］。无论是用于研究还是治疗，细胞和组织低温保存的整个过程都充满了风险［11］。生物样本的保存环境和运输条件会严重影响样本质量，对检测结果至关重要［12］。在心脏移植手术中，心脏保存液是一个非常重要的因素，其保存效果直接影响着移植心脏的功能状态、患者的临床预后及远期生活质量［13］。本研究将核酸病毒样本以及豚鼠皮肤的组织样本保存在自研的组织保护剂中，结果证实组织保护剂对病毒载量以及皮肤组织样本RNA 具有很好的保护效果，能够满足安全高效运输样本的要求。

病毒样本的保存和运输条件对其检测结果的准确性至关重要［14］。本研究探究了组织保护剂对核酸病毒的保存效果，结果证实核酸病毒在4 ℃条件下放置30 d，25 ℃条件下放置7 d 以及37 ℃条件下放置24 h，Ct值均在初始Ct值附近波动，证实组织保护剂对病毒载量具有很好的保护效果，有助于检测的高效性和准确性。随着分子生物技术在生物学、医学等方面的广泛应用，从生物实验材料成功提取总RNA 是保证后续实验正常进行的必要前提［15］。豚鼠皮肤组织样本RNA 的保护效果探究中，在4 ℃放置30 d，25 ℃放置7 d以及37 ℃放置24 h后，组织保护剂保存样本RNA的提取量、RNA 条带完整性、纯度与液氮保存组及市售RNA later 保存组均无统计学差异。上述结果表明，组织保护剂与市售RNA later 均具有对RNA质量和纯度的保护效果。

上述结果表明河北纳科生物科技有限公司生产的组织保护剂对核酸病毒载量以及豚鼠皮肤组织中的RNA 具有良好的保护效果。在不需液氮的情况下，组织保护剂对豚鼠皮肤组织的RNA 具有良好的保护效果，这将降低实验的研发成本并保护研发人员的安全。此外，本公司组织保护剂配方中95%原料来自国产原料，极大降低了实验成本。综上所述，本公司成功开发生产的组织保护剂，能够代替传统的冷冻保存组织样本，安全有效降低实验样本的储存成本。