重组胶原蛋白妇科凝胶对大鼠宫颈炎的治疗作用

刘鑫，李华，齐磊，杨利霞，于月欣，徐兰举

河北纳科生物科技有限公司，石家庄 050000

宫颈炎主要症状为外阴瘙痒、小腹坠痛、白带增多等，严重者会引起月经紊乱、不孕不育等［1］，严重影响了妇女身体健康及生活质量。目前，宫颈炎的患病风险较高，约有60%～80%的育龄期妇女患病［2］。临床上将宫颈炎分为急性和慢性2种，急性宫颈炎常表现为宫颈颈管黏膜红肿，阴道分泌物增多呈脓性变化，伴有子宫内膜炎，如治疗不及时会进展为慢性宫颈炎，症状反复，难以治愈，患者的生活质量显著下滑［3-4］；慢性宫颈炎多表现为宫颈柱状上皮异位、宫颈肥大、息肉、外翻以及宫颈腺囊肿等［5-7］，其诱发的损伤会导致乳头瘤状病毒感染，增加罹患宫颈癌的风险［8］。宫颈炎症的存在可能在艾滋病毒的传播中发挥作用，会增加病毒复制和病毒的易感性［9］。临床上多采用抗生素治疗宫颈炎，该方式不良反应较大，在杀灭病原菌的同时，也会杀灭大量健康菌群，从而破坏阴道微环境平衡［10］。因此，研发治疗宫颈炎的安全有效的药物具有重要的临床价值。

胶原蛋白在组织中发挥着重要的作用。阴道黏膜及宫颈组织中富含胶原蛋白，总的胶原蛋白比例远超过其他组织，它能维持黏膜组织的厚度和弹性，保持黏膜湿润［11-12］。绝经生殖泌尿综合征临床诊疗专家共识［13］中指出：重组胶原蛋白可增加阴道粘膜的细胞外基质，维持细胞和血管的生长并降低炎症反应，改善萎缩症状，缓解性交痛，并可通过增加阴道分泌物，改善绝经生殖泌尿综合征（genitourinary syndrome of menopause，GSM）所致的阴道症状。研究者前期采用基因工程技术、高密度发酵与蛋白纯化技术制备了纯度高、溶解性好、免疫原性低的重组人Ⅲ型胶原蛋白，实验结果表明其可以有效促进上皮细胞生长，细胞相容性良好［14］。细胞迁移和细胞粘附实验也证明重组胶原蛋白可显著促进小鼠成纤维细胞L929 的迁移和粘附，是一种理想的生物医用材料。本研究将重组胶原蛋白开发成局部用的妇科凝胶剂，并应用于大鼠宫颈炎的治疗，通过外源补充胶原蛋白，加速宫颈损伤黏膜的修复，旨在为宫颈炎的临床治疗提供一种新的手段。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验选取60 只SPF 级健康、性成熟未交配的Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠，由北京斯贝福生物有限公司提供，体重180～220 g，动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0100。饲养条件：温度18～22 ℃，相对湿度40%～60%，噪音85 分贝以下，氨浓度15 mg·m-3以下，通风换气8次·h-1。

1.2 主要试剂与仪器

苯酚购自天津永大公司（20210503），黄蓍树胶粉购自北京索莱宝公司（G9390），甘油购自天津永大公司（20210910），苏木素-伊红染色试剂盒购自北京索莱宝公司（G1120），4%多聚甲醛购自武汉博士德生物公司（AR1068），马松（Masson）三色染色试剂盒购自北京雷根生物公司（DC0032），Ki-67 抗体购自美国Immunoway 公司（YT5348），IL-6 抗体购自Affinity 公司（AF0198），光学显微镜购自日本奥林巴斯公司（BX43），多功能真彩色细胞图象分析管理系统美国购自Media Cybernetics 公司（Image-Pro Plus），石蜡切片机购自德国LEICA 公司（RM2016）。

1.3 大鼠宫颈炎模型构建

实验采用随机数字表法将60 只SD 大鼠分为6组，每组10只。其中正常组SD 大鼠不做任何处理，正常喂养，其余5组（50只大鼠）按不同凝胶治疗制备宫颈炎模型［15］。阳性对照组使用保妇康凝胶处理（白马药业）；GG00 组使用空白凝胶处理（基础组分配方基质，不含重组胶原蛋白）；实验组：GG01 组使用重组胶原蛋白含量为1 mg·g-1的妇科凝胶处理（批号GG01-20221101），GG02 组使用重组胶原蛋白含量3 mg·g-1的妇科凝胶处理（批号GG02-20221102），妇科凝胶为河北纳科生物科技有限公司自研产品。重组胶原蛋白按照发明专利中公开的方法制备获得［16］。

造模方法：首先使用异氟烷麻醉大鼠，用12号大鼠灌胃针头轻轻插入大鼠阴道约2 cm 深处，注入25%苯酚胶浆0.25 mL，用棉球固定阴道口，保持大鼠倒立状态2 min，隔天给药1 次，共计5 次。造模过程中观察阴道变化，给予苯酚胶浆5 次后大鼠阴道口红肿，有脓性物流出，表示造模成功。

造模成功后，次日开始分组治疗。阳性对照组、GG00 组、GG01 组、GG02 组分别给予0.25 mL对应药物进行治疗。每日给药1次，并记录大鼠体重，外阴红肿及阴道口脓性分泌物情况等。模型组按上述给药方式给予相应的0.9%氯化钠溶液，连续给药10次后麻醉处死大鼠，进行组织取材 。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 大体观察 观察并记录治疗前后大鼠外阴和体重的变化。治疗10 d 后，对各组大鼠进行眼球取血，利用显微镜计数法测定白细胞总数。

1.4.2 组织病理学观察 取各组大鼠阴道至子宫分角处部位组织，观察组织水肿情况。将取材组织在4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋、切片，分别进行HE 染色和Masson 染色实验，观察并记录大鼠阴道至宫颈组织形态学变化，胶原纤维的沉积情况以及黏膜、黏膜下间质形态学的炎性改变。

1.4.3 IL-6 蛋白及Ki-67 蛋白免疫组化染色 将石蜡包埋切片后进行IL-6 蛋白及Ki-67 蛋白免疫组化染色，在显微镜下观察并拍照。结合阳性细胞率及阳性细胞染色强度进行免疫组化染色评分（immunoreative score，IRS）［17］。阳性细胞率分级如下：阳性细胞数0～1%计为0 分，1%～10%计为1 分，10%～50%计为2 分，50%～80%计为3 分，80%～100%计为4 分。阳性细胞染色强度分级如下：无染色计为0 分，弱染色计为1 分，中等染色计为2 分，强染色计为3 分。将阳性细胞率评分和染色强度评分相乘，即得到IRS 评分。IRS 评分结果体现了IL-6 和Ki-67 的表达水平和分布情况，以此来评价重组胶原蛋白凝胶在大鼠阴道和宫颈组织中炎症反应及对组织细胞增殖能力的调节作用。

1.5 统计分析

运用SPSS 19.0 进行数据统计分析，各组数据以均数±标准差表示，组间比较采用双尾t检验。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 苯酚胶浆成功诱导大鼠宫颈炎模型

如图1所示，SD 大鼠经苯酚胶浆处理5次后，阴道口出现明显红肿，并且有脓性分泌物流出，表明大鼠宫颈炎模型造模成功。

图1 苯酚胶浆诱导的SD大鼠宫颈炎模型阴道外观Fig.1 Vaginal appearance of the rat model of cervicitis induced by phenol mucilage

2.2 大鼠体重和白细胞总数的变化

对实验前后大鼠的体重变化进行统计，由表1可知，与实验开始前体重相比，模型组大鼠体重显著低于正常组，治疗后阳性对照组、GG00组、GG01 组、GG02 组体重高于模型组。模型组大鼠血液中白细胞总数高于正常组，阳性对照组、GG01 组及GG02 组低于模型组，提示模型组及各治疗组体重减轻可能与炎症导致的大鼠食量减少等因素有关。上述结果表明，重组胶原蛋白妇科凝胶和阳性对照组保妇康凝胶可有效缓解宫颈炎大鼠的体重减轻，减轻大鼠体内炎症。

表1 大鼠体重及白细胞总数指标的比较Table 1 Comparison of body weight and total WBC in rats

2.3 大鼠外阴大体观察

研究观察并记录了各组中SD 大鼠治疗前后外阴红肿以及脓性分泌物情况，发现正常组SD大鼠外阴无红肿和脓性分泌物等情况，模型组大鼠均可见阴道口红肿、有脓性分泌物流出。阳性对照组、GG01 组、GG02 组未见脓性物流出，脓性分泌物显著减少。与GG00 组相比，GG01、GG02 组有显著治疗效果，且GG02 组治疗效果更好，与阳性对照组接近，说明可恢复到正常组水平。结果表明，GG01、GG02 组对大鼠宫颈炎模型具有明显的治疗效果，可以显著逆转模型组出现的阴道红肿和脓性分泌物情况。

2.4 大鼠阴道及宫颈组织病理形态学改变

大鼠阴道及宫颈组织的修复情况如HE 染色和Masson 染色结果所示（图2）。正常组大鼠宫颈黏膜在光学显微镜下可见复层扁平上皮组织，组织未见明显异常改变。上皮组织可见少量小血管，大量胶原纤维沉积并有序排列。与正常组相比，模型组大鼠宫颈组织部分鳞状上皮组织破损，出现细胞变性、坏死脱落；上皮层可见炎性细胞浸润，黏膜及黏膜下固有层充血和大量炎性细胞浸润，腺体有不同程度地增生及鳞状上皮化；阴道组织出现粘膜下充血和炎性细胞浸润，上皮下有大量中性粒细胞浸润；模型组仅观察到极少量胶原纤维的沉积。与模型组相比，阳性对照组炎性细胞浸润极少，上皮无明显变性和坏死，胶原沉积量接近于正常组水平，但胶原纤维排列不规则。在治疗组中GG00 组大鼠组织形态有轻微改善，大鼠宫颈黏膜鳞状上皮出现增生修复且稍增厚，可见大量炎性细胞浸润，炎性渗出物和少量坏死组织，可见胶原纤维局部沉积；而GG01、GG02组阴道及宫颈组织炎症程度明显较轻。其中，GG01组可见少量炎性细胞浸润，未见明显炎性坏死组织；GG02组局部组织可见极少量的炎性细胞浸润，上皮无明显变性和坏死情况，表现出更多的胶原沉积以及有序规整的胶原纤维束，更接近于正常组大鼠的天然组织状态，治疗效果优于阳性对照组。

图2 大鼠宫颈组织HE和Masson染色结果Fig.2 HE and Masson staining results of rat cervical tissues

2.5 免疫组化染色结果

由图3、表2 免疫组化结果可知，模型组Ki-67表达水平显著低于正常组（P＜0.05）；阳性对照组、GG01、GG02 组Ki-67 的表达水平显著高于模型组（P＜0.05）；GG00 组与模型组相比未见明显变化。模型组IL-6 分泌水平显著高于正常组（P＜0.05）。阳性对照组、GG01、GG02 组治疗后，IL-6 的表达水平明显低于模型组（P＜0.05），表现为炎症减轻，而GG00 组炎症没有明显缓解；GG02 组和阳性对照组Ki-67 和IL-6 的表达水平与正常组接近，结果无统计学差异（P＞0.05）。结果表明，GG02 组对大鼠宫颈炎具有显著治疗效果，可使细胞增殖和炎症反应恢复到正常组水平。综上所述，重组胶原蛋白妇科凝胶可以降低宫颈炎大鼠组织中炎症因子IL-6 的表达，同时促进细胞增殖和组织修复。

表2 各组大鼠阴道及宫颈组织Ki-67蛋白及IL-6蛋白指标的比较Table 2 Comparison of Ki-67 protein and IL-6 protein indexes in vaginal and cervical tissues of rats in each group

图3 大鼠宫颈组织Ki-67和IL-6免疫组化结果Fig.3 Immunohistochemical results of Ki-67 and IL-6 in rat cervical tissue

3 讨论

宫颈炎是一种多发的妇科疾病，给越来越多的女性带来困扰。不合理的治疗会发展成慢性宫颈炎，增加宫颈癌和人体免疫缺损病毒（human immunodeficien virus，HIV）传播的发病风险［8］。本研究开发的重组胶原蛋白妇科凝胶对急性宫颈炎模型鼠具有显著的治疗效果，可改善阴道黏膜组织细胞外基质（extracellular matrix，ECM），为细胞提供更好的微环境。

胶原蛋白在减缓皮肤衰老、促进皮肤创面愈合以及组织黏膜修复中具有重要的调节作用［18-19］。人体α型胶原蛋白Ⅰ型衍生肽刺激人真皮成纤维细胞中的胶原合成、伤口愈合和弹性蛋白生成［20］。重组人Ⅲ型胶原蛋白也被证明是修复损伤角膜和心脏的极好的ECM［21］。高血糖、氧化应激以及异常炎症反应均会造成人体黏膜组织中的微环境发生改变，造成组织中Ⅰ、Ⅲ胶原蛋白的降解和功能异常，导致黏膜组织难以愈合［22-23］。过度活跃和持续的炎症反应、蛋白水解酶水平改变以及ECM 缺乏会导致慢性创伤的愈合异常［24］。阴道内给药重组人Ⅲ型胶原蛋白修复阴道上皮，可促进ECM 的组装［12］。同时，重组胶原蛋白具有趋向引导作用，能够引导上皮细胞迁移至受损部位，有效促进组织再生，加速黏膜屏障功能的恢复过程。

本研究结果显示，重组胶原蛋白妇科凝胶在GG01组（1 mg·g-1）即对急性宫颈炎模型大鼠有一定的疗效，GG02组（3 mg·g-1）治疗效果更显著，可有效促进大鼠宫颈组织的再生修复。GG02 组治疗后大鼠阴道处的红肿减轻，阴道分泌物减少，阴道水肿改善。大鼠宫颈组织炎性细胞浸润减少，无上皮细胞变性和坏死情况，血管充血减少，宫颈组织中胶原沉积增加且有序排列。Ki-67 表达水平显著增加，IL-6表达水平恢复到正常组水平，感染状况明显改善。值得注意的是，GG02组在促进胶原沉积和有序排列方面优于阳性对照组。上述结果表明，重组胶原蛋白凝胶与宫颈组织的亲和性好，能修复阴道上皮组织和血管中的受损细胞，恢复细胞正常的代谢、增殖功能，帮助阴道上皮组织细胞逐渐恢复正常，提高细胞活力。

综上所述，本公司开发的重组胶原蛋白妇科凝胶对急性宫颈炎模型大鼠具有良好的治疗作用，通过局部给药能够有效促进宫颈组织黏膜的再生和快速修复愈合，为其临床应用提供良好的理论支持。