重组人源Ⅲ型胶原蛋白对豚鼠紫外线辐射损伤皮肤的修复效果探究

刁立琴，李华，施麟，于月欣，谢媛，王亚如，徐兰举

1.河北省药品医疗器械检验研究院，石家庄 050227；2.河北纳科生物科技有限公司，石家庄 050000

皮肤由表皮层和真皮层组成，是人体重要的器官，具有保护、分泌、体温调节以及感知外界刺激等功能［1］。皮肤是抵御有害生物、物理和环境污染物的第一道防线，包括紫外线（ultraviolet，UV）辐射。紫外线可以使身体合成对生命至关重要的维生素D，然而过量接触会产生有害影响。紫外线辐射已被描述为影响皮肤细胞的主要物理因素之一，容易导致皮肤炎症、早衰和癌症的发生［2］。紫外线辐射按波长分为紫外线A（UVA，315～400 nm）、紫外线B（UVB，280～315 nm）和紫外线C（UVC，100～280 nm）［3］。UVA 辐射是造成皮肤损伤的主要因素，皮肤过度暴露于UVA 辐射下，会产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括单线态氧、超氧阴离子和过氧化氢。ROS 与富含脂质的膜、酶和细胞DNA 相互作用，会改变细胞结构并干扰其功能的发挥［4］。UVB 的破坏作用比UVA 强1 000 倍，可以通过抑制人体表皮细胞的活力而导致皮肤光老化。UVC 可以被臭氧层过滤掉，因此UVB 被认为是阳光中最有害的成分［5-6］。紫外线辐射对皮肤的生物效应是基于光吸收和内在能量转换的，可导致面部皱纹、色素沉着、粗糙和毛细血管扩张。过度的紫外线辐射会破坏胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖，导致皮肤结缔组织损伤，从而影响皮肤的强度、弹性和水合作用［7］。长期暴露在太阳辐射下，不仅会引起光化性损伤，如晒伤和光化性皮炎，还会导致基底细胞癌和其他皮肤癌的发生［8］。

皮肤细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是皮肤干细胞生态位的一个重要组成部分，支持皮肤细胞的黏附、迁移、增殖和分化，直接影响皮肤的组织发育和再生过程［9］。胶原蛋白属于蛋白家族，被认为是ECM 的关键结构蛋白，支持天然组织的形态和完整性。因此，胶原蛋白在组织工程中有着广泛的应用［10］。所有波段的紫外线辐射都会破坏胶原纤维，加速皮肤老化［11］。重组胶原蛋白是通过将胶原蛋白的天然基因序列或重新优化设计的基因序列，导入选定的宿主细胞中，如大肠杆菌和酵母菌，经过培养、发酵、分离纯化等工艺，获得具有一定天然胶原蛋白特征和主要功能的蛋白质［12］。研究发现，重组人源Ⅲ型胶原蛋白（recombinant human type Ⅲ collagen，rhCol Ⅲ）交联制备的水凝胶能促进糖尿病创面皮肤的修复和再生［13］，rhCol Ⅲ对皮肤的修复再生具有重要的调节作用。

与大鼠或小鼠相比，豚鼠的皮肤结构在解剖学和生理学上更类似于人类皮肤［14］。因此，本研究选择豚鼠为实验动物，利用紫外线辐射造成豚鼠皮肤损伤后，将rhCol Ⅲ原料涂抹在皮肤损伤处，以探究其对豚鼠光毒损伤皮肤的修复效果。

1 材料与方法

1.1 试验动物

SPF 级Hartley 豚鼠，体重范围在250～350 g，由青岛康大爱博生物科技有限公司提供，合格证号为370823231100050256，许可证号为SCXK（鲁）2021 0003。

1.2 实验试剂与仪器

实验试剂：重组人源Ⅲ型胶原蛋白原料（河北纳科生物科技有限公司，批号Z-3CH-004），L929细胞（中科院上海生命科学研究院细胞资源中心），MEM 培养液（赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司），异丙醇（天津市永大化学试剂有限公司），胎牛血清（Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd.），高密度聚乙烯膜（Hatano Research Institute），氯化钠注射液（石家庄四药有限公司），市售胶原蛋白产品（湃克泰德，鳕鱼胶原蛋白肽粉，批号YF030004-3），HE 染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），Vimentin 抗体（美国Proteintech公司），HMB45 抗体（英国Abcam 公司），DAB 显色试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）。

实验仪器：荧光显微镜（日本OLYMPUS 公司），二氧化碳培养箱（德国宾德BINDER 公司），石蜡切片机（德国莱卡公司），生物组织摊烤片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司），电子天平（美国梅特勒公司），高压蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司），皮肤光毒性试验检测仪（天津开发区合普工贸有限公司）。

1.3 细胞毒性检测

细胞毒性检测的实验分组如下：空白对照组为10%胎牛血清的MEM 培养液；样品组为1、3、5、10 mg·mL-1rhCol Ⅲ和市售胶原蛋白产品（5 mg·mL-1），浸提介质为加入含10 %胎牛血清的MEM 培养液；阴性对照组为高密度聚乙烯膜按表面积3 cm2·mL-1比例加入含10 %胎牛血清的MEM 培养液，37 ℃浸提24 h；阳性对照组为10%DMSO溶液。

实验按照GB/T 16886.5—2017 规定的MTT方法进行。1×105·mL-1细胞悬液接种于96 孔板，每孔100 μL，37 ℃孵育24 h 后，去掉原培养液。孔内分别加入100 μL 空白对照液、阴性对照液、阳性对照液、rhCol Ⅲ样品液和市售组样品液，37 ℃孵育24 h。去掉原培养液，每孔加入50 μL浓度为1 mg·mL-1MTT 溶液，继续培养2 h 后吸出孔内溶液，加入100 μL 异丙醇，振荡10 min，在酶标仪570 nm 和650 nm 双波长下测定光密度（OD值）。

1.4 实验分组及造模方法

1.4.1 实验分组 随机数表法将30 只豚鼠分为6 组：正常组、模型组、1 mg·mL-1rhCol Ⅲ组、3 mg·mL-1rhCol Ⅲ组、5 mg·mL-1rhCol Ⅲ组和市售产品（5 mg·mL-1）组。正常组未进行紫外照射和给药处理，为正常状态的豚鼠。模型组进行紫外辐射造成豚鼠光皮肤损伤，在豚鼠辐射部位涂抹氯化钠注射液。1 mg·mL-1rhCol Ⅲ组、3 mg·mL-1rhCol Ⅲ组、5 mg·mL-1rhCol Ⅲ组和市售产品（5 mg·mL-1）组进行紫外照射以及辐射部位给药处理，涂抹rhCol Ⅲ和市售产品溶液，每只豚鼠涂抹0.3 mL。rhCol Ⅲ和市售产品使用氯化钠注射液溶解，配制为所需实验浓度。

1.4.2 造模方法 照射前，在豚鼠背部3 cm×3 cm区域内剃毛，使用脱毛膏脱毛，使皮肤充分暴露。豚鼠放在皮肤光毒性试验检测仪（UVA+UVB）灯具正下方30 cm 处照射，辐射参数设为UVA（4.5 mJ·cm-2·s-1）+UVB（0.036 mJ·cm-2·s-1），每周照射2次，连续照射4周。每次辐射时间：30、40、50、60、70、80、90、100 min，累计共520 min。除正常组外其他组每次照射后立即涂抹相应试验样品。

1.5 豚鼠光损伤皮肤的大体观察

对各实验组豚鼠的皮肤状态进行观察记录，按照表1 进行豚鼠皮肤刺激反应评分，并对各实验组修复效果进行评价。

表1 豚鼠皮肤皱纹情况评分标准Table 1 Scoring criteria for skin wrinkles in guinea pigs

1.6 苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色

组织取材固定后，使用石蜡包埋、切片。切片后在二甲苯中脱蜡8 min，换用新鲜的二甲苯，再脱蜡8 min。将玻片依次放入以下溶液：无水乙醇5 min、90 %乙醇2 min、80 %乙醇2 min、70 %乙醇2 min、蒸馏水2 min。苏木素染色液染色60 min，浸自来水中冲洗去除多余的染色液，约10 min，然后蒸馏水再洗涤一遍。分化液分化约20 s，自来水冲洗10 min。伊红染色液染色1 min。脱水、透明、封片。显微镜下观察，细胞核呈蓝色，而细胞浆呈粉红色或红色。

1.7 免疫组化染色

取各实验组豚鼠的皮肤组织，进行波形纤维蛋白（Vimentin）抗体和黑色素瘤单克隆抗体45（human melanoma black 45，HMB45）的免疫组化染色，以检测各实验组豚鼠皮肤组织中2 种蛋白的表达情况，进而评价成纤维细胞纤维化与黑色素瘤的发生风险。

1.8 统计分析

SPSS 20.0 软件进行实验数据的统计学分析。计量资料用平均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析。当P＜0.05时，差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 重组人源Ⅲ型胶原蛋白原料的细胞毒性检测

本研究通过MTT 实验，探究了不同浓度rh-Col Ⅲ组以及市售组对L929 细胞的毒性。从图1中看出，与空白对照组相比较，阴性对照组的吸光度值无显著差异（P＞0.05）。与空白对照组相比，阳性对照组的吸光度比值显著下降（P＜0.001），提示其存在细胞毒性。与空白对照组相比较，1 mg·mL-1rhCol Ⅲ组的吸光度值上调，但无统计学差异（P＞0.05）；3 mg·mL-1rhCol Ⅲ组、5 mg·mL-1rhCol Ⅲ组以及市售组的吸光度值显著上调（P＜0.01），表明在该浓度下的样品可显著促进细胞增殖；10 mg·mL-1rhCol Ⅲ组吸光度值显著上调，但无统计学差异（P＞0.05）。上述结果表明，rhCol Ⅲ无细胞毒性，且3 mg·mL-1和5 mg·mL-1浓度下可以促进细胞生长。

图1 rhCol Ⅲ的细胞毒性分析Fig.1 Cytotoxicity analysis of rhCol Ⅲ

2.2 皮肤组织大体观观察

根据rhCol Ⅲ原料的安全性检测结果，其在浓度为3 mg·mL-1和5 mg·mL-1时，具有更明显的促细胞生长作用。胶原蛋白浓度为10 mg·mL-1时，样品的渗透压有可能会超过细胞的正常渗透压，影响细胞的生长［15］。因此，本研究探究了1、3 和5 mg·mL-1胶原蛋白对豚鼠紫外线损伤皮肤的修复效果。在样品涂抹治疗后，根据表1皮肤皱纹情况评分标准，进行各实验组豚鼠皮肤状态恢复情况的大体观比较。结果如表2所示，与正常组相比较，模型组豚鼠的皮肤更粗糙，存在深皱纹的情况。与模型组相比较，1 mg·mL-1rhCol Ⅲ组豚鼠皮肤存在浅皱纹的情况；3 mg·mL-1rhCol Ⅲ组豚鼠皮肤存在细磨痕情况；5 mg·mL-1rhCol Ⅲ组豚鼠皮肤皱纹评分更低，改善更加明显；市售组皮肤也得到明显改善，但效果不如5 mg·mL-1rhCol Ⅲ组。

表2 豚鼠光损伤修复治疗后的皮肤皱纹情况比较Table 2 Comparison of skin wrinkles in guinea pigs after light damage repair treatment

2.3 皮肤组织病理学观察

图2 为紫外线辐射后，各组豚鼠皮肤组织的形态变化。正常组豚鼠表皮层的厚度均一且较薄，成波浪型分布；真皮层中的胶原纤维束排列紧密，无明显炎症反应。模型组豚鼠表皮层焦化严重，厚度明显增加；真皮层的胶原纤维束纤细，且炎症细胞数目多，发生了较明显的炎症反应。与模型组相比较，各治疗组均有不同程度的治疗效果。其中，5 mg·mL-1rhCol Ⅲ组的治疗效果最好，该组豚鼠的皮肤状态更接近于正常组豚鼠。5 mg·mL-1rhCol Ⅲ组豚鼠的表皮层较薄，且呈波浪型分布；真皮层胶原蛋白纤维束紧密排列，明显改善了紫外线辐射引起皮肤真皮层组织的炎症反应病变。该结果表明，5 mg·mL-1rhCol Ⅲ对光损伤皮肤的修复治疗具有明显的效果，可以使受损组织恢复至正常组小鼠皮肤的组织状态。

图2 各实验组HE染色分析Fig.2 HE staining analysis of each experimental group

2.4 皮肤组织Vimentin免疫组化分析

Vimentin 是间充质细胞中的一种Ⅲ型中间丝纤维蛋白，为上皮-间充质转化（epithelial to mesenchymal-transition，EMT）的主要标志蛋白。Vimentin 可以维持细胞的完整性，提供抗压能力，其在胃肠道肿瘤、乳腺癌及肺癌等多种上皮性癌中呈现过表达状态［16］。Vimentin 与皮肤损伤后修复及瘢痕增生有关，紫外辐射会造成其表达升高，可用于检测真皮层成纤维细胞的增生情况［17］。Vimentin 染色结果如图3所示，模型组中Vimentin表达明显，证实豚鼠在紫外辐射后的成纤维细胞发生明显增生，会使皮肤产生瘢痕。各治疗组皮肤组织中的Vimentin 表达降低，改善了皮肤组织的过度增生。该结果表明，rhCol Ⅲ具有良好的抵抗紫外辐射的作用，可以调节紫外辐射刺激引发的皮肤瘢痕增生。

图3 各实验组Vimentin免疫组化分析Fig.3 Immunohistochemical analysis of Vimentin in each experimental group

2.5 皮肤组织HMB45免疫组化分析

HMB45在大多数恶性黑色素瘤和激活的黑色素细胞中表达，如某些交界性痣细胞、非典型痣、创伤性痣和蓝痣的黑色素细胞［18］。HMB45免疫组化染色是恶性黑素瘤的经典诊断和鉴别方式［19］。由图4 可知，HMB45 的主要表达位置为皮肤组织的表皮基底层和毛囊上皮层。HMB45阳性染色细胞数目显示，与正常组相比较，模型组中HMB45的表达明显增加，表明紫外线辐射大大增加了黑色素瘤的发病风险。与模型组相比较，1 mg·mL-1rh-Col Ⅲ组、3 mg·mL-1rhCol Ⅲ组、5 mg·mL-1rhColⅢ组以及5 mg·mL-1市售组中HMB45 的表达水平均发生显著下降，其中5 mg·mL-1rhCol Ⅲ组中阳性染色细胞数目更低。该结果表明，rhCol Ⅲ原料的涂抹治疗可以降低紫外线辐射鼠皮肤黑色素瘤的发病风险。

图4 各实验组HMB45免疫组化分析Fig.4 Immunohistochemical analysis of HMB45 in each experimental group

3 讨论

皮肤恶性肿瘤是常见的癌症，其治疗和监测需要高昂的医疗费用。户外活动时，间歇性UV辐射可能会引发皮肤癌［20］。UV 辐射被证实是皮肤癌最明确的诱因，包括恶性黑色素瘤和非黑色素瘤［21］。在UV 辐射损伤过程中，皮肤组织中的炎症细胞增多，纤维解体，角质层增厚［22］，同时UV辐射增强了透明质酸酶和弹性酶的作用，导致皮肤组织中弹性纤维的退化、胶原纤维的大量减少和基质的消失。此外，真皮中胶原蛋白（Ⅰ型和Ⅲ型）原纤维和弹性蛋白的正确和均匀排列会影响皮肤的强度和弹性。当皮肤暴露在UV 辐射下会产生胶原酶和胸腺嘧啶二聚体，造成胶原蛋白缺失，进而导致皮肤老化［23］。胶原蛋白作为体外细胞基质中最主要的天然成分，在体内具有毋庸置疑的优势［24］。在本研究中，我们证实rhCol Ⅲ原料对豚鼠UV 辐射损伤皮肤修复具有明显的治疗效果。

本研究证实rhCol Ⅲ原料对L929细胞无潜在的细胞毒性，安全性良好。通过体内动物实验，深入探究了rhCol Ⅲ对UV 辐射损伤皮肤的修复作用，结果表明rhCol Ⅲ原料可以明显改善豚鼠皮肤光毒损伤下的病理组织变化，发挥抗紫外线辐射的治疗效果。模型组豚鼠在紫外线辐射后，发生明显的组织病理学改变，表皮增生明显，真皮层炎症反应加重。rhCol Ⅲ原料涂抹治疗后，皮肤表皮层较薄，且呈波浪型分布，真皮层胶原蛋白纤维束紧密排列，促进了紫外线辐射损伤皮肤的恢复情况。Vimentin 和HMB45 免疫组化结果证实，各实验组中Vimentin 和HMB45 的表达下调，可以改善成纤维细胞的增生情况以及降低黑色素瘤的发病风险。更重要的是，5 mg·mL-1rhCol Ⅲ原料对豚鼠光毒损伤皮肤的治疗效果更好，且优于相同浓度的市售产品组。

综上所述，rhCol Ⅲ原料对L929 细胞无潜在细胞毒性，且对光毒损伤皮肤具有明显的修复效果，可用于开发皮肤紫外线辐射损伤治疗的护理产品，在皮肤医学修复领域具有重要的应用价值。