元蘑多糖的结构特征及其调节巨噬细胞免疫活性机制

王子璇 隋玉 尚学钰 马思嘉 吴天香 刘洋 王琦，3

（1. 吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，长春 130118；2. 吉林农业大学植物保护学院，长春 130118；3. 吉林农业大学中药材学院，长春 130118）

元蘑（Sarcomyxa edulis）隶属于担子菌门（Basidiomycota）、蘑菇纲（Agaricomycetes）、蘑菇目（Agaricales）、小菇科（Mycenaceae）、美味扇菇属（Sarcomyxa）［1］，又称冻蘑、冬蘑等。中医认为，元蘑味鲜，性质温和，还具有除湿活血、舒缓经络、祛风等作用［2］。元蘑营养美味，分布广泛，且已实现人工栽培，具有重要的经济和药用价值。

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，具有分泌细胞因子、调控机体平衡以及保护机体免受外界病原体侵害等多种生物学功能［3］。多糖是真菌中重要的活性成分，大量研究表明，食药用菌多糖如裂褶菌多糖［4］、羊肚菌多糖［5］等可调节免疫细胞，促进其细胞因子的产生，增强其吞噬功能，进而提高机体免疫能力［6］。

现已研究发现，元蘑多糖具有保护肠道健康［7］、抗氧化［8］、降血糖［9］、抗衰老［10］、抗疲劳［2］等多种生物活性，而其对巨噬细胞的免疫活性尚未见报道。本研究以元蘑多糖为研究对象，采用DEAE-52离子交换层析和Sephacryl S-400葡聚糖凝胶过滤层析对其进行分离纯化，采用高效凝胶渗透色谱法、傅里叶变换红外光谱分析等方法，明确其理化性质和结构特征，并系统考察了其对巨噬细胞免疫调节作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 元蘑（干品）由黑龙江省牡丹江市温春农校提供，RAW264.7细胞由吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心提供。DEAE-52纤维素、5%中性红染液购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8购自Biosharp；Trizol、反转录试剂盒、qPCR试剂盒购自SparkJade；胎牛血清、胰酶购自Hyclone；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、一抗（β-actin）、GAPDH、Histone H3、二抗均购自Servicebio。

1.1.2 仪器与设备 多功能酶标仪、ICS5000离子色谱仪（Thermo Fisher Scientific）；ST 16R高速冷冻离心机（日立）；BSZ-100自动部分收集器（上海青浦沪西仪器厂）；BPN-80CH CO2培养箱（上海恒一）；XD-101倒置生物显微镜（德国Zeiss）；D3024R台式高速冷冻离心机（Dragonlab）；荧光定量PCR扩增仪（赛默飞）；MX-F涡旋混合器、BV-2垂直电泳仪、BT-2转印电泳仪购于Servicebio。

1.2 方法

1.2.1 元蘑多糖的提取与分离纯化 参照隋玉等［11］水提醇沉法提取多糖。精确称取元蘑子实体干品500 g，粉碎后加入去离子水，料液比为1∶30（g/mL），提取温度80℃，提取时间3 h，以8 000 r/min的速度离心12 min，收集上清液，将其浓缩至原体积的1/4，加入3倍体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心15 min，转速为6 000 r/min，收集的沉淀即为多糖粗品，干燥备用。使用Sevag法除蛋白后，选择截留分子量为3 500 Da的透析袋流水透析48 h，冻干得到元蘑多糖SEP。

将元蘑多糖SEP进行DEAE-52离子交换层析。配制4 mg/mL的SEP溶液，缓慢沿DEAE-52纤维素凝胶柱（1.8 cm×25 cm）柱壁均匀上样，依次用蒸馏水、0.1 mol/L、0.3 mol/L NaCl进行洗脱，流速1 mL/min，6 mL/管，不同洗脱梯度各收集50管。采用苯酚-硫酸法［12］对各管收集的洗脱液进行检测，以管数为横坐标，490 nm处吸光度值为纵坐标绘制洗脱曲线，并收集水洗多糖组分，命名为SEP-0。

进一步对SEP-0进行Sephacryl S-400葡聚糖凝胶过滤层析，配制10 mg/ mL SEP-0溶液，除杂除气泡后缓慢推进上样，用0.15 mol/L NaCl进行洗脱，流速0.5 mL/min，4 mL/管，收集40管。采用苯酚-硫酸法对每管收集的样品进行多糖含量检测，并绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线收集单一峰作为多糖组分SEP-0a。

1.2.2 元蘑多糖理化性质检测

1.2.2.1 多糖含量测定 采用苯酚-硫酸法对元蘑多糖SEP-0a进行多糖含量检测。向含有200 μL浓度为0.25 mg/mL的元蘑多糖溶液中加入100 μL 5%苯酚溶液后，再加入500 μL 98%浓H2SO4，室温条件下静置20 min，490 nm处检测吸光度值（OD值），根据葡萄糖标准曲线计算样品多糖含量。

1.2.2.2 蛋白含量测定 采用考马斯亮蓝法［13］对蛋白含量进行测定。向含有1 mL浓度为1.0 mg/mL的元蘑多糖SEP-0a中加入5 mL考马斯亮蓝G250溶液，室温静置5 min，595 nm处检测吸光度值（OD值），根据标准曲线计算样品蛋白质含量。

1.2.2.3 均一性及分子量测定 采用高效凝胶渗透色谱法（High Performance Gel Permeation Chromatography Evaporative Light-scattering Detector，HPGPC-ELSD）对元蘑多糖SEP-0a进行均一性及分子量检测。配制5 mg/mL SEP-0a溶液，过滤采用0.22 μm水系滤膜进行，进样量为10 μL，按照色谱条件进行洗脱，记录保存色谱图，按照标准曲线方程计算样品的分子量。

色谱条件：检测器为RID-10A视差折光检测器，TSK-gel G-3000PWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm），柱温：35℃，流动相：0.2 mol/L氯化钠水溶液，流速：0.6 mL/min。

1.2.2.4 单糖组成检测 采用离子交换色谱法（Ion Exchange Chromatography High Performance Liquid Chromatography，IEC-HPLC）对元蘑多糖SEP-0a进行单糖组成的分析。称取5 mg（±0.05 mg）SEP-0a，加入5 mL三氟乙酸（2 mol/L），温度121℃，加热2 h，通入N2，加3 mL甲醇洗涤并吹干，重复上述步骤3次，加入无菌水溶解，用0.22 μm滤膜过滤，转移至色谱瓶，上机检测。

色谱条件：DionexTMCarboPacTMPA10液相色谱柱（4.0 mm×250 mm，10 μm），柱温：30℃，电化学检测器，流动相：A相：H2O；B相：100 mmol/L NaOH，进样量：20 μL，流速：0.5 mL/min。

1.2.3 元蘑多糖的红外光谱分析 称取元蘑多糖SEP-0a 1.9 mg与KBr粉末190.0 mg，使其充分混匀后进行压片，在傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR）波长频率为4 000-400 cm-1的范围内扫描检测，重复3次，取平均值。

1.2.4 SEP-0a对巨噬细胞存活率的影响 采用CCK-8法［14］检测SEP-0a对巨噬细胞存活率的影响。取浓度为2.5×104个/mL的RAW264.7细胞接种于96孔板，在含有5%二氧化碳恒温（37℃）培养箱中培养12 h，弃上清，设置6个实验组，分别为空白对照组（DMEM基础培养液）、SEP-0a不同浓度给药组（50、100、500、1 500 μg/mL）、阳性对照组（LPS 1 μg/mL），继续培养24 h，吸掉培养液，加入CCK-8（CCK-8∶DMEM基础培养液=1∶10）100 μL，避光培养45 min，450 nm处检测吸光度值，计算细胞存活率。

1.2.5 SEP-0a对巨噬细胞吞噬作用的影响 采用中性红法［15］检测SEP-0a对巨噬细胞吞噬作用的影响。将RAW264.7细胞（5 000个/孔）接种于96孔板，在含有5%二氧化碳恒温（37℃）培养箱中培养24 h，弃去上清，设置6个实验组，分别为空白对照组（DMEM基础培养液）、SEP-0a不同浓度给药组（50、100、500、1 500 μg/mL）、阳性对照组（LPS 1 μg/mL），继续培养24 h，吸掉培养液。配制0.1%中性红染液，加入100 μL，在含有5%二氧化碳恒温（37℃）培养箱中避光培养60 min，弃上清，用PBS（200 μL/孔）进行清洗，重复3次，加入细胞裂解液（100 μL/孔）裂解2 h，此操作避光进行，在540 nm处检测吸光度值。

1.2.6 SEP-0a对巨噬细胞产生ROS的影响 采用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针法［16］检测SEP-0a对巨噬细胞产生ROS的影响。取浓度为5×104个/mL的RAW264.7细胞接种于96孔板，在含有5%二氧化碳恒温（37℃）培养箱中培养12 h，弃去上清，设置6个实验组，分别为空白对照组（DMEM基础培养液）、SEP-0a不同浓度给药组（50、100、500、1 500 μg/mL）、阳性对照组（LPS 1 μg/mL），继续培养24 h，将培养液吸出，每孔加入DCFH-DA 200 μL，培养箱培养20 min，用不含血清的基础培养液洗涤3次后再加入200 μL基础培养液，在激发波长为488 nm，发射波长为525 nm的条件下检测荧光强度。

1.2.7 SEP-0a对巨噬细胞分泌NO影响 采用一氧化氮法［17］检测SEP-0a对RAW264.7细胞分泌NO影响。取浓度为2.5×105个/mL的RAW264.7细胞接种于96孔板，在含有5%二氧化碳恒温（37℃）培养箱中培养12 h，弃上清，设置6个实验组，分别为空白对照组（DMEM基础培养液）、SEP-0a不同浓度给药组（50、100、500、1 500 μg/mL）、阳性对照组（LPS 1 μg/mL），继续培养24 h，吸取上清，在新的96孔板中，加入50 μL的细胞上清与稀释后的标准品，每组4个复孔，先分别加入Griess Reagent I（50 μL/孔），然后立即加入Griess Reagent II（50 μL/孔），在540 nm处检测吸光度值。

1.2.8 SEP-0a对巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6的影响 采用ELISA法［18］检测SEP-0a对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6的影响。将RAW264.7细胞（5 000个/孔）接种于96孔板，在含有5%二氧化碳恒温（37℃）培养箱中培养24 h，弃去上清，设置6个实验组，分别为空白对照组（DMEM基础培养液）、SEP-0a不同浓度给药组（50、100、500、1 500 μg/mL）、阳性对照组（LPS 1 μg/mL），继续培养24 h，吸取上清，并将其转移至新的无菌离心管中，2 500 r/min离心20 min，取上清待测。使用ELISA试剂盒根据说明对TNF-α、IL-1β以及IL-6进行测定，在450 nm处检测吸光度值。

1.2.9 SEP-0a对巨噬细胞中TNF-α、IL-1β以及IL-6基因表达的影响 采用qPCR法［19］检测SEP-0a对RAW264.7细胞中TNF-α、IL-1β以及IL-6基因表达的影响。取浓度为1×106个/mL的RAW264.7细胞接种于6孔板，在含有5%二氧化碳恒温（37℃）培养箱中培养24 h，弃去上清，设置6个实验组，分别为空白对照组（DMEM基础培养液）、SEP-0a不同浓度给药组（50、100、500、1 500 μg/mL）、阳性对照组（LPS 1 μg/mL），继续培养24 h，吸取细胞悬液至新的无菌管中，离心收集细胞，每管加1 mL RNA提取液（Trizol），吹打细胞至完全裂解后静置5 min。按照5∶1的比例加入200 μL氯仿后混匀静置3 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上层无色水相并加入等体积的异丙醇，颠倒混匀沉淀15 min，离心弃上清。加入1 mL 75%乙醇洗涤，4℃ 12 000 r/min离心5 min，弃上清后离心管倒置晾干，加入20 μL无菌水使其充分溶解得到总RNA。按照反转录试剂盒说明书，将总RNA反转录成cDNA，进行qPCR检测，根据2-△△Ct相对定量法计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.10 SEP-0a对巨噬细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 采用Western blot法［20］检测SEP-0a对巨噬细胞NF-κB通路蛋白表达的影响。将RAW264.7细胞（1×106个/孔）接种于6孔板，在含有5%二氧化碳恒温（37℃）培养箱中培养23 h，弃去上清，按要求加入BAY11-7082和DMEM基础培养液后培养1 h，弃去上清，设置8个实验组，其中分别为空白对照组（DMEM基础培养液）、阳性对照组（LPS 1 μg/mL）、SEP-0a不同浓度给药组（50、100、500、1 500 μg/mL）、500 μg/mL SEP-0a（加入10 μmol/L BAY11-7082孵育过的一组）、抑制剂组（10 μmol/L BAY11-7082孵育过的另一组与DMEM基础培养液），继续培养24 h，弃上清，PBS重复洗涤两次，将细胞悬液转移至离心管中，离心5 min，4℃ 1 200 r/min，弃去PBS，向离心管内加入RIPA裂解液3-5 min。裂解时间为30 min，此操作在冰上进行，离心10 min，条件为4℃ 12 000 r/min，上清为总蛋白溶液。

BCA法定量蛋白，加入5×上样缓冲液，进行15 min沸水浴，-20℃保存备用。蛋白样品进行SDSPAGE电泳，电转移至PVDF膜。加入5%脱脂牛奶后将其室温封闭30 min，加入一抗（1∶1 000），4℃孵育摇床过夜。TBST中脱色摇床快速洗脱5 min，一共洗脱3次，加入二抗（1∶5 000），室温慢摇30 min，TBST中脱色摇床快速洗脱5 min，一共洗脱3次。采用ECL化学发光法检测目的条带的信号强度，曝光条件要根据不同的发光强度进行调整，保存成像。

1.2.11 SEP-0a对巨噬细胞在使用NF-κB特异阻断剂后的促进作用 取浓度为2.5×105个/mL的RAW264.7细胞接种于96孔板，在含有5%二氧化碳恒温（37℃）培养箱中培养12 h，弃去上清，设置4个实验组，其中两组加入用基础培养液稀释为10 μmol/L的BAY11-7082 100 μL，剩余两组分别加入100 mL DMEM基础培养，在含有5%二氧化碳恒温（37℃）培养箱中孵育培养1 h，取出后弃去上清，其中加入BAY11-7082组在弃去上清以后，一组加入SEP-0a 500 μg/mL，一组加入DMEM基础培养液，剩余两组也分别加入DMEM基础培养液与500 μg/mL SEP-0a，放回培养箱继续培养24 h后，吸取上清于无菌离心管中，在2 500 r/min下离心20 min。NO检测方法同1.2.7，细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的检测方法同1.2.8，NO、TNF-α、IL-1β、IL-6基因检测方法同1.2.9，引物序列见表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

2 结果

2.1 元蘑多糖分离纯化

采用DEAE-52离子交换层析对元蘑多糖SEP进行分离纯化。如图1-A所示，经过蒸馏水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl洗脱后，得到3个多糖组分，收集含量最高的水洗多糖组分并命名为SEP-0。

图1 元蘑多糖洗脱曲线Fig. 1 Elution curve of S. edulis polysaccharide

进一步利用Sephacryl S-400葡聚糖凝胶过滤层析对元蘑多糖SEP-0进一步纯化得到多糖组分SEP-0a，洗脱曲线如图1-B所示，SEP-0a为单一对称峰。

2.2 理化性质测定

成分测定结果表明，元蘑多糖SEP-0a中总糖含量为81.67%，未检测到蛋白质含量。

采用HPGPC-ELSD法对元蘑多糖SEP-0a的分子量进行检测。如图2所示，SEP-0a分子量洗脱峰为单一对称峰，表明其为均一多糖组分。按照标准曲线（y=-0.162 6x+7.407 9，R2=0.995 9）计算得到SEP-0a的相对分子量为4.23×104Da。

图2 SEP-0a高效凝胶渗透色谱洗脱曲线Fig. 2 Elution curve of SEP-0a high performance gel permeation chromatography

采用IEC-HPLC法对元蘑多糖SEP-0a的单糖组成进行检测。结果如图3所示，元蘑多糖SEP-0a主要由半乳糖（Gal）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）和岩藻糖（Fuc）组成，其摩尔百分比为48.27∶26.02∶16.26∶9.03。

图3 SEP-0a离子色谱图Fig. 3 SEP-0a ion chromatogram

2.3 傅里叶变换红外光谱分析

进一步采用傅里叶变换红外光谱检测元蘑多糖SEP-0a的结构，结果如图4所示，3 388 cm-1处有信号峰的出现，这是因为O-H的伸缩振动；在2 929 cm-1周围的吸收峰是C-H的伸缩振动；吸收峰出现在1 353 cm-1、1 147 cm-1和1 074 cm-1，这意味着SEP-0a含有吡喃糖环；β-D-吡喃糖的特征吸收峰在872 cm-1处表示；因为802 cm-1和附近存在吸收峰，所以还证明了α构型的存在。

图4 SEP-0a红外光谱图Fig. 4 Infrared spectrum of SEP-0a

2.4 SEP-0a对巨噬细胞增殖的影响

采用CCK-8法检测SEP-0a对RAW264.7细胞增殖的影响，结果如图5所示，随着SEP-0a浓度不断增加，其细胞增殖率也逐渐提高，并且具有一定的浓度依赖性。当SEP-0a浓度在100-1 500 μg/mL的范围时，与空白组相比差异极显著（P＜0.01），说明SEP-0a可以增强巨噬细胞的增殖能力。

图5 不同浓度SEP-0a对RAW264.7细胞增殖的影响Fig. 5 Effects of SEP-0a at different concentrations on the proliferation of RAW264.7 cells

2.5 SEP-0a对巨噬细胞吞噬作用的影响

采用中性红法检测SEP-0a对RAW264.7细胞吞噬作用的影响，结果如图6所示，随着SEP-0a浓度的增加，其吸光度值也逐渐增强，并且具有一定的浓度依赖性。当SEP-0a浓度为500-1 500 μg/mL时，与空白组相比有极显著差异（P＜0.01）。这表明SEP-0a可以增强巨噬细胞的吞噬能力。

图6 不同浓度SEP-0a对RAW264.7细胞吞噬作用的影响Fig. 6 Effects of SEP-0a at different concentrations on the phagocytosis of RAW264.7 cells

2.6 SEP-0a对巨噬细胞产生ROS的影响

采用2',7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）荧光探针法检测SEP-0a对RAW264.7巨噬细胞产生ROS的影响，结果如图7所示，随着SEP-0a浓度的不断升高，荧光强度逐渐增强，且具有一定的浓度依赖性，当SEP-0a浓度范围在500-1 500 μg/mL时，与空白组相比有极显著差异（P＜0.01），说明其可促进RAW264.7细胞产生ROS。

图7 不同浓度SEP-0a对RAW264.7细胞分泌ROS的影响Fig. 7 Effects of SEP-0a at different concentrations on the ROS secretion of RAW264.7 cells

2.7 SEP-0a对巨噬细胞分泌NO影响

采用一氧化氮法检测SEP-0a对RAW264.7细胞分泌NO影响。结果如图8所示，NO的含量随着SEP-0a浓度的增加而提高，并与空白组相比，差异极显著（P＜0.01），具有一定的浓度依赖性，这表明SEP-0a能提高RAW264.7细胞分泌NO的能力。

图8 不同浓度SEP-0a对RAW264.7细胞分泌NO的影响Fig. 8 Effects of SEP-0a at different concentrations on NO secretion by RAW264.7 cells

2.8 SEP-0a对巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6的影响

采用ELISA法检测SEP-0a对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-1β以及IL-6的影响。结果如图9所示，随着SEP-0a浓度梯度不断增加，TNF-α、IL-1β和IL-6的含量也逐渐提高，有一定的浓度依赖性。当浓度为100-1 500 μg/mL时，与空白组相比TNF-α与IL-6含量显著增加（P＜0.01）；而当浓度为500-1 500 μg/mL时，与空白组相比IL-1β含量显著提高，具有极显著性差异（P＜0.01），说明SEP-0a可促进RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6。

图9 不同浓度SEP-0a对RAW264.7细胞分泌TNF-α（A）、IL-1β（B）、IL-6（C）的影响Fig. 9 Effects of SEP-0a at different concentrations on TNF-α（A）, IL-1β（B）and IL-6（C）secretion by RAW264.7 cells

2.9 SEP-0a对巨噬细胞中TNF-α、IL-1β以及IL-6基因表达的影响

采用qPCR法检测SEP-0a对RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β以及IL-6基因表达的影响。结果如图10所示，随着SEP-0a浓度梯度不断增加，TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达量也显著增高，与空白组相比，差异极显著（P＜0.01）,有一定的浓度依赖性。说明SEP-0a可以促进巨噬细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6基因的表达，与ELISA结果一致。

2.10 SEP-0a对巨噬细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

NF-κB是一种重要的核转录因子，可以快速激活巨噬细胞，刺激转录系统，导致主要趋化因子、细胞因子和炎症介质的瞬时表达［21］。它是Rel家族中蛋白质异源或同源二聚化形成的重要转录因子之一，包括NF-εB1（也称为p50）、NF-ωB2（也称为p52）和RelA（也称为p65），其中p65是最为常见的形式，p65蛋白表达上调证明NF-κB通路被激活［22-23］。本研究进一步采用Western blot法考察了SEP-0a对巨噬RAW264.7细胞NF-κB通路蛋白表达的影响，实验结果如图11所示，随着SEP-0a浓度梯度增加，对RAW264.7细胞NF-κB信号通路p-p65蛋白表达上调越明显，具有一定的浓度依赖性，差异极显著（P＜0.01）。但是在加入BAY11-7082抑制剂后，p-p65蛋白表达则会明显下调。该实验结果进一步证实SEP-0a能够通过NF-κB信号通路调控巨噬细胞免疫功能。

图11 SEP-0a对RAW264.7细胞蛋白磷酸化的影响Fig. 11 Effects of SEP-0a on protein phosphorylation in RAW264.7 cells

2.11 SEP-0a对巨噬细胞在使用NF-κB特异阻断剂后的促进作用

BAY11-7082是一种NF-κB的特异性阻断剂，采用通路阻断法初步研究SEP-0a对RAW264.7细胞的免疫调节作用。结果如图12，RAW264.7细胞经BAY11-7082抑制剂与SEP-0a共同作用下，与SEP-0a组比，其NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达量显著下降（P＜0.01），这说明BAY11-7082抑制剂阻断了SEP-0a刺激RAW264.7细胞NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。

图12 NF-κB抑制剂对SEP-0a诱导RAW264.7分泌NO（A）、TNF-α（B）、IL-1β（C）和IL-6（D）的影响Fig. 12 Effects of NF-κB inhibitors on the secretions of NO（A）, TNF-α（B）, IL-1β（C）and IL-6（D）induced by SEP-0a in RAW264.7 cells

基因表达变化数据如图13，RAW264.7细胞经BAY11-7082抑制剂与SEP-0a共同作用下，与SEP-0a组比，其NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表达明显减弱（P＜0.01），与ELISA结果一致。进一步说明SEP-0a可以激活NF-κB信号通路从而发挥免疫调节作用。

图13 NF-κB抑制剂对SEP-0a诱导RAW264.7中NO（A）、TNF-α（B）、IL-1β（C）和IL-6（D）基因表达的影响Fig. 13 Effects of NF-κB inhibitors on SEP-0a on the gene expressions of NO（A）, TNF-α（B）, IL-1β（C）and IL-6（D）by RAW264.7 cells

3 讨论

多糖的相对分子质量、单糖组成等与它的生物活性紧密相关［24］。Li等［25］对元蘑多糖NTHSP进行分离纯化，检测其结构组成发现NTHSP是分子量为1.19×103-1.55×104Da，并且由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的一种具有高分支结构的葡聚糖。Li等［26］研究元蘑多糖结构，结果得到元蘑多糖HW-HSP分子量分布为3.87×104-4.62×106Da，并且由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和核糖5种单糖组成，含有O-H、C-H以及吡喃糖环等。本研究获得的元蘑多糖SEP-0a主要由半乳糖、甘露糖、葡萄糖和岩藻糖组成，相对分子量为4.23×104Da，并且具有α构型与β构型，与其他元蘑多糖相比，其单糖组成及分子量分布均不相同，因此，推测本研究发现的SEP-0a可能是一种新的元蘑多糖。

巨噬细胞对于机体免疫系统来说十分重要，可以分泌ROS、NO、TNF-α、IL-1β和IL-6等，具有调节免疫、抑制癌细胞增殖等作用［27］。ROS可以氧化细胞脂质，使蛋白质失活，并杀伤病原微生物及自身异常细胞［28］。NO是重要的活性介质，对病毒及癌细胞等的免疫应答有着抑制和杀伤作用，从而使免疫能力得到提高［29］。TNF-α可以激活中性粒细胞和淋巴细胞，并促进其他细胞因子的合成和释放［30］；IL-1β常大量产生在炎症初期阶段，其可以对局部进行激活，同时也是继发性炎症介质产生的诱因之一［31］；IL-6作为十分重要的促炎细胞因子，可以诱导B细胞的分化以及T细胞增殖分化，影响抗体的产生，参与机体免疫应答［32］。研究发现，真菌多糖具有较好的免疫活性。苗月等［33］发现蛹虫草多糖可以增强巨噬细胞的吞噬活性，促进NO和IL-1β的分泌，调节小鼠巨噬细胞RAW264.7免疫活性。Ren等［34］发现可以刺激RAW264.7产生NO、IL-6和TNF-α并且增强它们的活性从而调节其对RAW264.7巨噬细胞的潜在免疫活性。郝正祺等［35］发现绣球菌子实体多糖能够提高巨噬细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-3、IL-10、IFN-β免疫因子mRNA的表达量。本研究考察了元蘑多糖组分SEP-0a对巨噬细胞RAW264.7的体外免疫调节活性，并发现经过元蘑多糖SEP-0a给药后，RAW264.7细胞的增殖与吞噬能力显著提高，并且可以增强ROS和NO的分泌，提高TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，均具有剂量依赖性。说明本研究报道的元蘑多糖SEP-0a对巨噬细胞RAW264.7具有较强免疫调节活性。

NF-κB可以通过快速调节细胞内基因的表达来调节某些生理和病理过程，作为核转录因子，它很容易被激活，从而诱导信号级联反应的发生，进行核转位，启动下游基因的转录，促进蛋白的表达及炎症相关因子的合成与分泌［36-37］。其中p65是NF-κB信号通路中最常见的形式，它在NF-κB通路中的表达通常与局部或全身的细胞炎症反应呈正相关，因此p65蛋白表达上调可以证明NF-κB信号通路被激活［38］。Liao等［39］发现竹荪多糖可以通过MAPK/NF-κB信号通路来调节NO和TNF-α等活性因子的分泌，从而发挥免疫调节作用。Wang等［40］发现NF-κB通路参与了黑虎掌菌诱导的RAW264.7细胞活化，经过NF-κB信号通路的抑制剂BAY11-7082处理后，其诱导RAW264.7细胞所分泌NO和TNF-α的能力被有效抑制。本研究发现，SEP-0a可以使NF-κB信号通路中p65蛋白磷酸化的表达被明显上调，但是在加入NF-κB特异阻断剂BAY11-7082后，NF-κB信号通路中p65蛋白的高表达则被抑制。同时，使用BAY11-7082与SEP-0a共同处理后，与SEP-0a组比其NO、TNF-α、IL-1β以及IL-6的表达量均明显降低。这些结果进一步证实，元蘑多糖SEP-0a能够通过NF-κB信号通路发挥巨噬细胞的免疫调节功能。

4 结论

本研究通过分离纯化从元蘑中获得一种新的均一多糖组分SEP-0a，该多糖主要由半乳糖、甘露糖、葡萄糖和岩藻糖组成，相对分子量为4.23×104Da，并且具有α构型与β构型。体外细胞实验证明SEP-0a可以通过NF-κB信号通路，提高巨噬细胞的增殖和吞噬能力，并增强ROS与NO的分泌，以及TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，进而发挥免疫调节作用。