高效液相色谱-荧光法测定饲料中维生素B1 和维生素B2

唐 雯， 黄 媛

（福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350015）

作为饲料添加剂， 维生素B1和维生素B2对养殖业具有至关重要的作用。 维生素B1参与营养代谢，影响动物心脑功能，同时对神经系统也有重要作用（王仁华等，2016；王宝维等，2014）。维生素B2是促进生长发育， 维持机体健康的必需微量营养物质，对禽类产蛋性能等具有很大影响（徐蕾蕾等，2019；张海涛等，2017）。因此，饲料中维生素B1和维生素B2含量的测定，对养殖业投料多寡具有极大参考价值。 目前，对其分析测定的方法主要有分光光度法（江蔓等，2016；郭亚东等，2004；李松青等，2001）、微生物法（Salvetti等，2003）、高效液相色谱法（严华等，2022；索德成等，2015；崔容等，2005）等。 分光光度法、微生物法都存在操作复杂，检测耗时长的缺点。 而高效液相色谱法具有高效、快速、准确的特点，尤为适用于对饲料中维生素B1、维生素B2的测定。运用高效液相色谱法测定饲料中维生素B1、维生素B2的研究较多，但对其二者的测定方法多为紫外检测 （张憬等，2018； 梁琳等，2016； 吴淑君，2002），且样品前处理多采用提取液超声提取（符金华等，2017；邢磊等，2016）。 维生素B1的紫外吸收较弱，紫外响应小，干扰大，对仪器的性能要求高， 且对含量较低的样品测定准确度降低；维生素B1和维生素B2的提取液不同（国家市场监督管理总局，2019； 国家市场监督管理总局，2018）， 导致同一样品需要分批处理， 工作量增大，不利于工作的开展。 本方法利用高温高压法对饲料进行提取， 随后对维生素B1进行衍生化操作，统一两者流动相，运用荧光法测定维生素B1和维生素B2， 旨在为饲料中维生素B1和维生素B2含量监控测定提供有效保障。

1 材料与方法

1.1 仪器超高效液相色谱仪Waters ARC HPLC（配荧光检测器），美国Waters 公司；压力蒸汽灭菌锅，上海东亚压力容器制造有限公司；Sartorius BSA 224S 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；高速台式离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；IKA MS 3 basic 单发涡旋振荡器，上海沪粤明科学仪器有限公司。

1.2 试剂 维生素B1（99.09%， 斯坦福分析化学）、维生素B2（97.36%，德国DR）；甲醇、乙酸钠、盐酸、正丁醇、铁氰化钾（分析纯，上海沪试化工有限公司）；氢氧化钾（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。 实验用水为一级水。

1.3 色谱条件 色谱柱：中谱红RD-C18 （150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol/L 乙酸钠-甲醇=65∶35（V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温： 35 ℃；检测器：荧光检测器；进样量： 10 μL；波长：维生素B1（激发波长375 nm、发射波长435 nm）；维生素B2（激发波长462 nm、发射波长522 nm）。

1.4 标准溶液配制及测定 维生素B1储备液：准确称取维生素B1标准品0.02 g， 用0.01 mol/mL盐酸溶液定容至25 mL。 维生素B2储备液：准确称取维生素B2标准品0.01 g， 用0.01 mol/mL 盐酸溶液定容至100 mL。维生素B1、维生素B2混合中间液： 准确移取维生素B1储备液1.00 mL，维生素B2储备液10.00 mL，用0.01 mol/mL 盐酸溶液定容至100 mL。维生素B1、维生素B2标准溶液图谱见图1 和图2。

图1 0.30 μg/mL 维生素B1标准溶液（衍生后）色谱图

图2 0.50 μg/mL 维生素B2 标准溶液色谱图

1.5 样品制备及测定 前处理：称取适量样品置于150 mL 锥形瓶中， 加入1 mL 50% 盐酸溶液，加入80 mL 水， 摇晃锥形瓶使样品与水混合均匀。 将混合后的样品置于高温灭菌锅中121 ℃高温提取30 min。待样品彻底冷却后，用150 g/L 氢氧化钾溶液调节样品pH 为5 ～6。 用水将样品转移并定容至250 mL 容量瓶，作为备用液。

维生素B1测定：取备用液2.0 mL 于试管中，加入1.0 mL 2 mg/mL 碱性铁氰化钾溶液，涡旋混合10 s，加入5 mL 正丁醇萃取，涡旋混合10 s，静置5 min。 取上层溶液1000 r/min 离心3 min 后，吸取上层清液上机测定。 另取标准溶液同法衍生后上机。

维生素B2测定： 取备用液过0.45 μm 滤膜后，上机测试。

2 结果与分析

2.1 线性关系及范围 取混合中间液0.200、1.00、2.00、10.0、20.0 mL，分别用水定容至50 mL。配制为标准溶液工作曲线。 色谱结果以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，计算得到线性范围、回归方程、相关系数（表1）。

表1 维生素B1、维生素B2 回归方程及线性范围

2.2 方法检出限及定量限 以3 倍信噪比（S/N）作为方法检出限，以10 倍信噪比（S/N）作为方法定量限，维生素B1的检出限为0.04 mg/kg，定量限为0.15 mg/kg；维生素B2的检出限为0.06 mg/kg，定量限为0.18 mg/kg。

2.3 加标回收 选取已知维生素B1、 维生素B2含量的饲料为基质， 分别进行不同水平的加标回收实验，各加标水平重复6 次实验，维生素B1、维生素B2的平均回收率均大于90%，RSD 均小于2.5%（表2）。

表2 饲料基质中维生素B1、维生素B2加标回收结果（n=6）

3 讨论

本方法与国标法的对比结果表明，国标法测定维生素B1需要根据不同的饲料类型选用不同的提取液，且配制步骤复杂，需进行pH 调节，无疑增加前处理时间，增大测试工作量。 市面上，饲料多为同时添加维生素B1、维生素B2，而国标法选用两种方法对其进行测定， 选用不同流动相，进一步增加测试时间。 本方法选用水作为提取液，同时提取维生素B1、维生素B2，用统一的流动相， 统一的检测方法， 大大缩短前处理时间，仪器准备时间，简化色谱条件，从根本上提高检测效率。

对低于15 mg/kg 的低含量饲料， 如配合饲料（梁玉树等，2016；莫彩娜等，2015），国标法无法得到准确结果。 本方法因远低于国标法的检出限、定量限，可应用于各水平含量的饲料测定工作。 国标法因采用紫外检测器分析，对上机工作液的纯净度有较高的要求， 需通过不同提取液来满足络合重金属、沉淀蛋白质等除杂要求，以期得到不受干扰的色谱结果。 特别要注意的是，维生素B1的紫外吸收响应低，即使选用特定提取液提取， 对含量低的饲料依然无法完全消除杂质对色谱结果的干扰， 给测定结果带来不确定性（图3、图4）。 本方法则直接选用荧光检测器，选择性更强，灵敏度更高，所得色谱结果不受杂质干扰，能够得到更加准确的测定结果。本方法与国标法方法比对结果见表3。

表3 本方法与国标法方法比对结果

图3 低含量饲料维生素B1 紫外色谱图

图4 低含量饲料维生素B2 紫外色谱图

为进一步确定该方法结果是否符合要求，取6 份具有代表性的饲料，分别进行本方法及国标法测定，对两者结果进行比较。结果见表4，本方法与国标法维生素B1、 维生素B2测定值比较相对偏差均小于5%，符合国标法规定的相对偏差不大于5% 的要求。

表4 本方法与国标法比对结果及相对偏差

4 结论

本文建立了高效液相色谱-荧光法测定饲料中维生素B1、维生素B2的方法。 本方法采用高温高压法进行样品前处理，对维生素B1进行衍生化处理，最终采用荧光法测定。 本方法无需配制特定提取液，使用统一的流动相，在同台仪器上测定，简化了样品前处理过程，进一步缩短了仪器准备时间，优化了色谱条件，提高了检测效率。 荧光法因其更加灵敏的特点，扩大了饲料含量测定范围。 色谱结果表明，本方法回收率大于90%，能满足分别在5、 7 min 内完成对维生素B1、维生素B2的测定，适用于所有类型的饲料检测工作。 为测定维生素B1、维生素B2提供了一种简单、高效、准确的方法，对国标法进一步扩大检测范围，提高检测效率具有现实意义。