运用绵羊颈外静脉构建面颈部静脉畸形动物模型

杨霞 沈艳玲 郭军 刘源 闫志伟 杨向明 吴炜 冯瑶 杨耀武

静脉畸形(venous malformations, VMs)是由静脉发育异常引起的一种血管畸形,可以单独发病,也可以和其他血管畸形联合出现,范围可以从局部的浅表病变到涉及多个功能区的弥散样病变[1-2]。VMs可出现在身体各个部位,好发于面颈部。目前硬化治疗是VMs首选的治疗方法,常用的硬化剂有平阳霉素、博来霉素、聚桂醇、聚多卡醇、十四烷基硫酸钠、3%鱼肝油酸钠等。此外,临床研究发现,无水乙醇硬化治疗、纤维蛋白胶复合平阳霉素栓塞硬化治疗等技术在大范围、高回流VMs治疗方面显示了良好的疗效。在VMs治疗领域硬化剂的种类以及治疗方法众多,但是长期以来缺乏进行疗效评价的动物模型,尤其是缺乏能够用于治疗过程观察、疗效对照研究以及新技术、新方法实验研究的实用性模型,导致对各种治疗方法引起静脉纤维化作用的机理以及疗效评价缺乏实验研究依据。自2013 年以来,我科脉管疾病研究团队尝试以绵羊颈外静脉为基础,通过手术方法构建了面颈部VMs动物模型,该模型在解剖形态、血流动力学方面虽然与人类VMs仍有一定差异,但是仍有望初步用于硬化治疗等的过程观察以及特定治疗技术的疗效评价研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择健康成年绵羊5 只,体重25～35 kg,雌雄不限,单侧颈外静脉作为实验对象。

1.2 实验方法

1.2.1 绵羊颈外静脉解剖及观察 术前24 h禁食水,手术当天使用电动剃毛刀将绵羊颈部被毛剃除,使用盐酸赛拉嗪注射液(陆眠宁,吉林华牧动物保健品有限公司)进行肌肉注射麻醉,约10 min后,待绵羊意识淡漠、自行倒卧后,将其侧卧位固定于手术台上,碘伏消毒手术区域并铺无菌洞巾。在隆起的颈外静脉略下方设计纵行切口,切口区使用2%利多卡因进行局部浸润麻醉,然后切开皮肤、皮下组织,翻瓣,于胸锁乳突肌外侧充分显露颈外静脉,向上解剖到下颌角平面,显露汇入颈外静脉主干的上颌静脉、舌面静脉,向下解剖至约6 cm处,观察颈外静脉走行、分支并测量其外径。

1.2.2 VMs动物模型制备 模型构建标准:依据人类有回流静脉VMs的解剖学和血流动力学特征,按照尽量接近和相似原则,预期目标为VMs动物模型有较粗的静脉管腔、较细的回流静脉以及较细的汇入静脉。汇入静脉有多支,除远心端缩窄外,保留部分沿途汇入的静脉细支,回流静脉由颈外静脉主干缩窄而成。

模型静脉长度设计为3 cm。首先通过主干缝线缩窄、汇入分支静脉缩窄或结扎等方法处理颈外静脉上端(远心端),使汇入静脉孔径缩窄至2～3 mm,模型下端(近心端)缩窄至1～3 mm,制备完成后创面止血,分层缝合,碘伏纱布覆盖伤口。术后等待绵羊自然苏醒,并肌注青霉素(2 次/d,共3 d)抗感染。

1.2.3 绵羊VMs动物模型评价 手术后4 周观察及取材。绵羊颈部术区剃毛,麻醉方式同前。首先通过多普勒超声观察VMs模型及汇入静脉和回流静脉的形态、孔径、血流动力学等情况。随后沿颈外静脉略下方纵行切开、翻瓣,显露颈外静脉,大体观察后取材,4%多聚甲醛液固定标本,并行脱水包埋处理,制作蜡块并切片, HE及Masson三色法染色,光学显微镜(奥林巴斯)下观察标本静脉壁结构及管腔情况,对动物模型进行综合评价。在实验过程中如果出现缝扎线移位脱落、术区感染、模型形态不符合要求等现象,剔除该标本并补充新的实验动物。

2 结 果

2.1 绵羊颈外静脉观察

绵羊颈外静脉位于双侧颈部侧面皮下,臂头肌和胸头肌之间的颈静脉沟内,主干由上颌静脉、舌面静脉汇合而成(图1)。成年绵羊颈外静脉外径6～12 mm,平均外径9.3 mm,从远心端向近心端走形过程中有细的分支汇入,外径1～3 mm。观察发现,雄性绵羊颈外静脉的外径总体上大于雌性绵羊,体重大、羊龄长的绵羊颈外静脉外径总体上大于体重轻、羊龄短的绵羊。

图1 绵羊颈外静脉上段及主干手术改建前后形态

2.2 绵羊VMs动物模型观察及评价

绵羊颈外静脉经过主干缝线缩窄、分支静脉缩窄或结扎等处理后血液回流减慢,即刻出现模型区域静脉鼓起变粗(图1)。模型制备手术4 周后大体观察,见多数标本静脉孔径、体积与制备后即刻相比收缩变细,部分标本中心区隆起呈扩张形态,部分模型外周侧支静脉有扩张现象。多普勒超声检查显示制备成功的模型中心区域多数静脉管腔较粗,回流静脉、汇入静脉较细。部分模型有多支粗细不等的汇入静脉,部分模型静脉腔内有血栓样物形成,管腔变小。组织学检查显示模型区域静脉血管内皮及管壁结构与正常静脉接近,部分模型血管壁增厚。图2显示1 例VMs动物模型制备、大体观察、多普勒超声检查及组织学观察所见。

图2 绵羊颈外静脉VMs模型

3 讨 论

在VMs研究领域,学者们一直在探索并构建VMs动物模型。 Castillo等[3]用突变的PIK3CAH1047R在杂合子状态下和内源性启动子中以镶嵌方式诱导表达引起小鼠VMs,这些小鼠在出生时不同的部位均有皮下血管畸形。 Castel等[4]在转基因小鼠中使用Cre-loxP技术以组织特异性的方式表达激活的PIK3CAH1047R突变等位基因来产生VMs基因工程小鼠模型。小鼠中出现的病变经组织学检查类似于人类血管畸形,这些异常表现为扩张的海绵状血管腔。 Boscolo等[5]将表达TIE2-L914F的人脐静脉内皮细胞注射进免疫缺陷小鼠体内形成了VMs病变,并随着时间的推移不断扩大,该方法建立的模型表现出血管扩张,细胞层变薄且不连续等特征与人类VMs十分相似。国内学者在建立转基因裸鼠VMs动物模型方面取得了一定的进展[6]。尽管这些VMs动物模型在研究发病机制、潜在治疗药物方面能够发挥一定作用,但是因为构建的病变体积偏小,难以进行硬化治疗相关研究。高庆红等[7]和Zhao等[8]将家兔耳缘静脉用于平阳霉素、鱼肝油酸钠等硬化治疗机理研究,揭示了硬化剂对兔耳缘静脉的损伤及致纤维化作用。尽管如此,兔耳缘静脉因为孔径较细,其应用仍有一定的局限性。

在脑血管畸形、全身静脉曲张研究领域,很多学者应用外科手术或水囊缩窄等方法建立了动静脉畸形及静脉曲张动物模型。赵晓勇等[9]用外科手术方法成功建立了稳定高流量脑动静脉畸形动物模型,该模型简单、稳定、可重复性强。李健等[10]用血管吻合的方法建立了可操作性强,经济便捷又安全的动静脉畸形动物模型。方和平等[11]用水囊缩窄法建立了食管/胃底静脉曲张动物模型,以上研究为VMs动物模型构建提供了另一种思路。郑家伟等[12]的一项研究显示,成年山羊颈外静脉的平均外径可达5.4 mm,是头颈部血液回流的主干静脉。颈内静脉位于颈部血管神经束内侧,细小或缺如。成年绵羊体格更为高大,颈外静脉孔径更大。本课题组以绵羊颈外静脉为基础,通过手术结扎和缩窄等方法,初步建立了面颈部 VMs 动物模型。

研究显示,绵羊颈外静脉位置表浅,外径可达到6～12 mm,平均外径9.3 mm,因体重、羊龄、性别不同有较大差异。静脉内含瓣膜,管壁内膜较薄,外膜较厚,颈外静脉从远心端向近心端走形过程中粗细不等的分支静脉汇入。应用缝线缩窄、分支静脉结扎等方法改建后,初步形成了单囊腔VMs解剖形态,具有较粗的静脉管腔、较细的回流静脉以及多支较细的汇入静脉。多普勒超声及组织学观察其血流动力学特点、管壁结构类似于VMs病变。

在模型制备、观察过程中发现,绵羊颈外静脉被缩窄改建后,因即刻回流受阻,模型区域静脉有时会显著扩张,一定时间后可能形成腔内血栓,与人类VMs血管腔内的血栓相似。另一个现象是在手术后4 周,多数模型区域静脉孔径收缩变细、管壁增厚,这可能是因为静脉压力、血流动力学改变所致,也可能与手术微小创伤、血管外周纤维组织粘连有关。此外,模型制备也遇到一些问题。因为绵羊颈外静脉作为头颈部的主要回流静脉,其血液流速快、管腔压力大,部分制备的模型在手术4 周后出现缝扎线移位、脱落现象,颈外静脉恢复原来形态。在血流的长期冲击下,缝扎线移位现象导致在回流静脉孔径和血液流速精确控制方面存在一定的难点,相同构建方法制备出的动物模型在静脉体积、血液流速方面有一定差异。因此模型制备有一定的失败率,如果构建的动物模型不符合要求,需要重新制备。此外,通过绵羊颈外静脉构建VMs的目的是将其应用于治疗学研究,因静脉改建后即刻存在静脉损伤、组织水肿、潜在术后感染等问题,VMs模型处于不稳定状态,不适合用于治疗学研究,因此将其观察期定于改建后4 周。从观察结果看,制备成功的模型4 周后组织水肿消退,静脉及周围组织基本恢复正常。

该研究初步建立了有回流的面颈部VMs动物模型,其解剖学及血流动力学特征与转基因VMs动物模型小动物静脉血管相比,更有利于进行高回流VMs相关治疗学研究。因研究的主要目的不是从基因学角度构建VMs模型,因此未进行相关的分子生物学检测和免疫组织化学等检测。尽管静脉改建后其解剖形态及病理学特征与人类VMs仍有较大差异,但是在没有更理想选择的前提下,模型为该领域相关治疗学、影像学及治疗机理研究提供了一个有价值的手段。在后续研究中,课题组将进一步改进、优化模型构建及检测方法,使模型构建趋于科学化、标准化。