流体剪切下软骨祖细胞的转录组响应分析

须凌峰 张月姣 张建昌 余佳 霍婉秋 徐佳丽 王美青

颞下颌关节骨关节炎与异常咬合刺激关系密切[1-2]，本课题组前期研究表明，流体剪切力(flow fluid shear stress，FFSS)可通过多种信号途径，如mTOR途径[3]，CaSR途径[4]，引起软骨细胞凋亡、终末分化等异常反应。颞下颌关节软骨细胞根据分化程度可分为增殖细胞、前肥大细胞和肥大细胞等不同类型[5]，其中增殖细胞层中含有软骨祖细胞(chondroprogenitor cells，CPCs)。软骨祖细胞在关节软骨更新修复和稳态维持中扮演着重要的角色[6-7]。在课题组构建的单侧前牙反动物模型中，位于软骨深层的肥大细胞会首先凋亡，而位于软骨浅层(增殖层)的细胞则表现出较强的抵抗机械力刺激的能力[8]。为探索软骨祖细胞响应异常力刺激的规律，本研究通过第二代高通量RNA测序和生物信息学分析技术，从分子水平分析了软骨祖细胞在受到FFSS刺激后的变化，以期深入理解软骨祖细胞对异常力刺激的反应特点。

1 材料与方法

1.1 软骨祖细胞的分离与培养

取3 周龄雌性SD大鼠,使用手术刀分离髁突浅层软骨,组织块在无菌磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline, PBS)中漂洗后,在DMEM培养基中将其切碎成1 mm×1 mm组织块。收集组织,离心,弃上清。胰蛋白酶37 ℃消化20 min,然后使用Ⅰ型胶原酶(2 mg/mL)及Ⅱ型胶原酶(2 mg/mL)消化1 h。完全培养基终止消化,离心,弃上清,加入完全培养基重悬细胞。细胞培养于37 ℃,含5% CO2的细胞培养箱。培养至第3 代时用于后续实验。

1.2 流式细胞术

将第一代软骨祖细胞消化后制成单细胞悬液,调整细胞密度为1×107/mL。取100 μL上述细胞悬液,对照组不加抗体,实验组加入FITC anti-rat CD90 Antibody(Biolegend, 美国), 4 ℃孵育30 min。孵育完成后PBS反复洗涤细胞3 次,进行上机检测。

1.3 流体剪切力加载

体外培养至第2 代的细胞经消化收集后,接种于Flexcell StreamerTM(Flexcellint, 美国)Slips 玻片,约3 d长至80%融合时,对细胞加载1.2 Pa的流体剪切力(flow fluid shear stress, FFSS)刺激2 h。

1.4 转录组测序

使用TRIzol试剂(Ambion, 美国)进行总RNA提取检测RNA完整性和总量。合格的样品经过构建文库与质检后使用Illumina NovaSeq 6000(Illumina, 美国)测序。测序部分由北京诺禾致源科技股份有限公司提供技术支持。

1.5 生物信息学分析

1.5.1 主成分分析及相关性分析 通过诺禾云平台(https://magic.novogene.com)进行,用以评估样品间基因表达模式相似程度与组间可区分度。差异表达分析使用DESeq2软件(1.20.0)进行。本文设定padj<0.05 &|log2(foldchange)|>1为显著差异表达的阈值。

1.5.2 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 通过clusterProfiler(3.8.1)对差异表达基因进行KEGG通路富集分析及GO富集分析,分析结果分别以气泡图和柱状图进行展示。

1.5.3 差异基因蛋白网络互作分析 选择差异表达基因中|foldchange| Top 500的差异表达基因,通过预测蛋白质-蛋白质相互作用的STRING数据库(http://string.embl.de/)提取相互作用关系。随后将相互作用数据导入Cytospcape3.8.2软件,使用CytoNCA软件计算各节点介数中心度(betweenness, BC)。选择BC Top 200的节点构建相互作用网络和核心节点筛选,并通过Cytoscape3.8.2绘制PPI网络图。

1.6 定量反转录聚合酶连锁反应

使用TRIzol裂解细胞,按照说明提取总RNA。使用MightyScript 第一链 cDNA 合成Master Mix(上海生工)反转录为cDNA。使用SYBR Green染料法Mix(上海生工)进行定量,引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 统计与分析

数据使用GraphPad Prism9.0.0(GraphPad公司,美国)进行统计分析与绘制统计图。使用StudentT检验进行2 组间差异比较,P<0.05则认为存在统计学差异。

2 结 果

2.1 实验样本可靠性分析与差异表达

CD90是一种典型的干细胞表面标志物。流式细胞术结果显示,提取的大鼠髁突原代软骨细胞CD90阳性细胞率达到98.51%(图1)。经过Illumina测序后,对结果进行主成分分析,结果显示:对照组三个样本聚集紧密,而FFSS刺激组样本稍微分散,但仍能够很好地区分对照组和FFSS刺激组(图2A)。样本间Pearson 相关分析结果显示,对照组组内差异较小,而FFSS刺激组组内差异略大(图2B)。即:FFSS刺激后软骨祖细胞的基因型发生了明显变化,并能够很好地与对照组区分。

图1 软骨祖细胞CD90阳性细胞率

图2 主成分分析(A)与样本间相关性分析(B)

2.2 差异表达基因筛选

在FFSS刺激后的样本中共筛选出了1 996 个与对照组相比有显著差异表达的基因,其中1 348 个基因表达上调, 648 个基因表达下调(图3)。表2展示了上调和下调差异表达基因中排名前10的基因,显著上调的基因包括了溶质载体蛋白家族成员Slc6a12、 Slc25a48,补体家族成员C3,特异性受体酪氨酸激酶家族成员Adgrv1、脂联素家族成员Lcn2等。

图3 差异表达基因火山图

表2 Top10差异表达基因

2.3 GO和KEGG富集分析

为更加深入地研究软骨祖细胞在受到FFSS刺激后的反应机制,我们进行了上调和下调差异表达基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析, 并从中挑选了排名前20的信号通路进行可视化分析。

对上调差异表达基因的KEGG通路富集分析结果表明,软骨祖细胞对FFSS刺激的生物学反应主要集中在与炎性反应、免疫调节等生物学过程密切相关的信号通路,如TNF信号通路、IL-17信号通路、TOLL样受体信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、JAK-STAT信号通路和破骨细胞分化等相关信号通路;对下调差异表达基因的KEGG通路富集分析结果表明,软骨祖细胞主要受到细胞周期、p53信号通路、细胞外基质受体交互、Foxo信号通路、局部黏附、PI3K-Akt信号通路、细胞衰老以及Wnt信号通路等的影响。

对于上调差异表达基因进行GO功能富集分析后发现,受FFSS异常力刺激后,软骨祖细胞参与的生物学过程主要与细菌来源分子反应、脂多糖反应、血管生成、炎症反应及细胞分裂等相关,在细胞组分方面主要涉及细胞外基质、胶原三聚体、细胞膜等;在分子功能方面主要涉及软骨祖细胞对抗氧化活性、生长因子活性、受配体活性、细胞因子活性等。对于下调差异表达基因进行GO功能富集分析发现,软骨祖细胞的生物过程及细胞组分主要集中在多个与细胞分裂相关的活动中;在分子功能方面,软骨祖细胞主要涉及细胞骨架结合与活性改变等内容(图4);GO富集分析结果则显示,在生物学过程和细胞组分这两方面主要富集在与细胞分裂相关的活动中。

2.4 炎症及细胞周期相关基因表达

本研究在进行富集分析时发现:炎症反应和细胞周期改变是软骨祖细胞在异常力刺激下发生的重要生物学变化之一。为此,利用热图分别展示炎症反应相关基因和细胞周期相关基因的表达变化情况,结果表明:炎症相关基因(如Il-1α、Il1r1、Hif1-α、 Nfkb1、Ccl7等)的表达显著上调(图5A),细胞增殖相关标志物(如Mki67、 Ccnd1、 Ccnd1、 Pcna等)的表达显著降低,而周期素依赖性激酶抑制因子1A(Cdkn1a)的表达水平显著增高(图5B)。

2.5 PPI网络的构建

通过PPI网络分析,发现了几个核心基因,包括参与细胞增殖、凋亡等生物学过程的白细胞介素-6(Il6)、激活转录因子3(Atf3)、蛋白微管相关蛋白2(Stmn2)、趋化因子配体2(Ccl2)、视黄酸受体(Ret)、蛋白激酶Cγ(Prkcg)、核因子kappa B抑制因子α(Nfkbia)[9-14];涉及细胞移动与黏附相关生物学过程的血管细胞黏附分子1(Vcam1)和肌球蛋白(Acta1)[15-16],以及在调控氧化应激方面发挥重要作用的超氧化物岐化酶2(Sod2)[17](图6)。

图6 差异表达基因的蛋白网络构建及核心基因筛选

2.6 核心基因的验证

为了验证PPI网络挖掘的核心基因,通过qRT-PCR验证核心基因的表达量。结果显示Acta1、 Atf3、 Ccl2、 Il6、 Nfkbia、 Ret、 Vcam1的表达变化与测序结果一致(图7),而Sod2、 Stmn2表达无明显变化,Prkcg表达变化与测序结果相反(图7)。

图7 核心基因验证

3 讨 论

关节软骨是重要的负重组织,关节软骨细胞对负荷变化可做出相关的生物学响应。本文采用转录组学分析方法,探讨了下颌髁突软骨祖细胞响应FFSS刺激的生物学活动特点,结果表明:软骨祖细胞对FFSS的响应主要集中于炎性反应和细胞周期这两大生物学过程,信号通路涉及与细胞增殖、凋亡、分化、细胞移动、细胞代谢等生物学过程,Acta1、Atf3、Ccl2、Il2、Nfkbia、Ret、Vcam1在这些生物学过程中可能发挥重要作用。

位于浅层的软骨祖细胞具有增殖和向成熟软骨细胞分化的能力[18]。异常生物力在骨关节炎发生、发展过程中发挥着重要作用,并诱发明显的炎症反应[19]。白细胞介素-17(IL-17)是一种细胞因子,在骨关节炎病理过程可促进IL-1β、TNF、IL-6等炎性因子及基质金属蛋白酶和一氧化氮(NO)的生成[20],并促进骨关节炎恶化[21];PI3K/AKT/mTOR的激活能够促进软骨细胞增殖能力的恢复,对维持关节软骨组织稳态起重要作用,但该通路也参与骨关节炎的发生与发展[22],软骨细胞中IL-17 介导的 PI3K/AKT/mTOR 通路的激活,可促进软骨退变[23]。JAK-STAT被认为是细胞功能的中心节点之一,参与免疫适应、组织修复、炎症、凋亡、等多种生物学过程[24]。有报道指出:软骨细胞受到白细胞介素-1(IL-1)刺激时其增殖能力将下降,而抑制JAK2/STAT3信号通路则能部分恢复受损软骨细胞的增殖能力[25];而最近一项研究表明,JAK/STAT信号通路的激活能够促进软骨祖细胞衰老[26];肿瘤坏死因子-α/核因子-κB(TNF-α/NF-κB)信号通路是炎症反应中最重要的信号通路之一,抑制TNF-α/NF-κB信号通路的激活,可以抑制颞下颌关节软骨祖细胞的炎症反应并维持软骨生成能力[27]。本研究结果中PPI网络分析显示, Il6、Nfkbia等炎性和抗炎相关基因是互作网络中的核心分子。先前的研究表明流体剪切力能够刺激软骨细胞产生前列腺素E2(PGE2),诱导Il6的合成[20]。Atf3是骨关节炎发展的关键介质。炎性细胞因子通过NF-κB途径上调Atf3的表达,而Atf3缺乏会减弱IkB和p65的磷酸化状态,抑制NF-κB信号, 从而抑制软骨细胞中细胞因子诱导的Il6转录[28]。 Vcam1是一种重要的炎性反应介质, Vcam1表达增加与炎症及组织损伤有关[29]。而Nfkbia能够抑制与炎性反应相关的NF-κB/REL复合物。在FFSS刺激后,软骨祖细胞Nfkbia表达水平升高, 可能是细胞对于炎性过程的一种保护性反应。这些结果提示炎症反应是软骨祖细胞对异常力刺激的主要响应。

骨关节炎软骨中,软骨细胞通过改变代谢来适应骨关节炎中的炎性环境[30]。溶质载体(solute carrier, SLC)是一类负责物质在胞内胞外之间运输的跨膜蛋白,在细胞代谢过程中发挥着重要的作用[31]。本研究发现软骨祖细胞在受到FFSS刺激后,Slc6a12、Slc25a48的表达水平显著升高。尽管尚且没有溶质载体蛋白与骨关节炎发病相关的报导,但是这些结果提示溶质载体可能与骨关节炎病理过程中软骨细胞代谢改变相关。

总之, 本研究通过采用第二代高通量转录组测序技术,首次证明软骨祖细胞对于FFSS刺激的主要响应表现为炎症反应,并揭示了参与这一过程的几个重要炎性反应相关信号通路,如NF-κB、IL-17、MAPK、JAK-STAT、PI3K/Akt等,从而为进一步研究软骨祖细胞在力刺激作用下的功能活动特点及其可能的治疗靶向,提供了转录组学研究基础。