叶贤林 李彤 王若楠 李然 刘衡 曾劲峰
(深圳市血液中心,广东 深圳 518040)
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是目前全球有待解决的公共卫生问题之一。世界上约5%的人口感染慢性乙型肝炎,近25%的HBV 携带者发展为慢性乙型肝炎,可能导致肝硬化,甚至肝细胞癌[1-2]。在我国,乙肝是3 大传染病之一,每年约有30万患者死于乙肝相关疾病[3]。此外,HBV感染是导致癌症死亡的2 个常见危险因素之一[4]。乙肝疫苗接种是预防乙肝感染最有效方法之一,但由于疫苗3 针保护差异,疫苗接种无反应,抗体滴度下降(保护时间一般在8~12 年),基因型差异及病毒免疫逃逸株出现,使仍有新感染不断出现[5]。我国自1992 年开始对新生儿接种乙肝疫苗,2002年全部免费接种。为了探讨乙肝疫苗对献血人群乙肝感染的影响,我们通过对深圳市献血人群经过HBsAg和核酸NAT筛查后的乙肝感染者,进行两对半、巢式PCR、基因测序等方法检测,调查分析计划免疫后出生献血者的感染情况及基因突变情况,现报告如下。
2020年9月—2021年10月深圳市血液中心收集的1992 年1 月1 日后出生并经HBsAg ELISA 和ALT 初筛合格的无偿献血者标本46 632 份(男性31 612 份,女性15 020 份),其中HBsAg ELISA+共99份。
大容量病毒核酸提取试剂(罗氏公司,批号:39452000)。Premix Ex Taq 酶试剂盒(TAKARA 公司,批号:AJ52058A),DL2000 DNA Marker(TAKARA 公司,批号:A1301A);琼脂糖(BIOWEST 公司,批号:WXBB0828V);基因测序外送华大基因科技公司检测。Veriti Dx PCR 仪(ABI 公司),MX3005P实时荧光PCR 仪(Agilent 公司),5840 离心机(Eppendorf 公司),DK-8B 电热恒温水槽(上海精宏实验设备公司),水平电泳仪(上海伯乐公司),UV-254暗箱紫外透射仪(北京鼎国公司)。
1.3.1 HBV DNA提取
采用2.5 mL 核酸大容量提取方法提取标本血浆的HBV DNA。操作严格按照试剂说明书进行。
1.3.2 乙肝两对半检测
所有HBsAg ELISA+标本送广州金域(广州)科技有限公司采用罗氏化学发光法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb。
1.3.3 BCP/PC和S目的基因片段的扩增
以巢式PCR 扩增BCP/PC 和S 片段(长度为263 bp和496 bp),进行2轮扩增,用2%的琼脂糖凝胶进行水平电泳检测扩增产物,阳性标本的第2轮扩增产物外送深圳华大基因公司测序。
1.3.4 标本DNA定量检测
使用实时荧光定量PCR 仪和配套试剂对标本病毒载量进行测定。洗脱液上样量为5 μL,补蒸馏水至25 μL进行测定。
1.3.5 阳性结果判定
以下3种情况满足任意1种即为确证阳性:1)化学发光法:HBsAg 阳性;2)巢式PCR:S 片段或者BCP/PC 片段至少有1 个是阳性;3)实时定量PCR:阳性。
1.3.6 HBV S序列系统进化树分析
选取A-I 基因型HBV 野毒株各3 份,用MEGA7.0 系统进化软件以邻接法Kimura 2-parameter 模式,验证复数1 000,构建HBV S 序列系统进化树。
采用STATA 14.0 统计分析软件处理数据,分类变量资料采用χ2检验,连续变量资料采用Mann-Whitney U 检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
HBV感染献血者HBV检测总体结果见表1、表2,乙肝两对半检测结果见表3。
表1 HBV感染献血者检测总体结果(一)(n,%)Table 1 Overall results of blood donors infected with HBV(n,%)(Part1)
表2 HBV感染献血者检测总体结果(二)Table 2 Overall results of blood donors infected with HBV(Part2)
表3 61份确证阳性献血者标本血清学模式分布Table 3 Serological pattern distribution of 61 confirmed positive blood donor samples
不同性别HBV感染献血者HBsAg滴度取对数进行比较,P>0.05,见图1。
图1 不同性别HBV感染献血者HBsAg滴度比较Figure 1 Comparison of HBsAg titers in blood donors infected with HBV of different genders
共50份标本获得S序列,其中B型46份[(92%,46/50),男性38份,女性8份],C型4份[(8%,4/50),男性3 份,女性1 份],不同性别间比较无差异(P>0.05)。系统进化树分析见图2。
图2 HBV感染献血者HBV S基因系统进化树分析Figure 2 Phylogenetic tree analysis of HBV S gene in blood donors infected with HBV
46 份B 型乙肝感染者病毒株S 区突变频率高的是N40S(8/46,17.39%)、G44E(7/46,15.22%)、T126S/N/I/A(5/46,10.87%)、Q129H/R(6/46,13.04%)、Y161F/S(7/46,15.22%)、V179A(4/46,8.70%),其中免疫逃逸突变有T126S/N/I/A、Q129H/R。发现2 份G145R 免疫逃逸突变,男女各1 份。4 份C型乙肝感染者病毒株S 区突变频率高的是S53L(2/4,50%)、C69T(2/4,50%)、I126S/T(2/4,50%),其中免疫逃逸突变有I126S/T。在主要亲水区(MHR,aa99-aa169)经检测B型有63%(29/46),C型有50%(2/4)发生突变。
HBV 感染是危害人类生命安全的最严重问题之一。HBV 的感染特点为感染率高、感染人数众多、病程长、且缺乏特效药物及难以完全治愈[3]。目前预防HBV 感染最有效的措施就是注射疫苗。1992 年我国出台了《全国乙肝免疫接种实施方案》,将乙肝疫苗纳入计划免疫管理。随着乙肝疫苗在全国范围内的推行,我国的乙肝预防工作取得了初步成效。然而,HBV 在一些如宿主、免疫、病毒以及诱发因素的压力下容易产生突变,这是因为HBV反转录酶缺乏校正功能,其中S 基因发生的突变会影响HBV产生抗体免疫应答,影响疾病进展,这被称之为免疫逃逸相关突变。已有研究表明,HBVS基因区的变异,特别是S基因的a 决定簇和MHR 上的氨基酸变异,将会减少S 蛋白的分泌,同时降低与抗-HBs 的亲和力,从而导致HBsAg 检测失败以及HBV产生免疫逃逸现象[5]。目前,计划免疫后出生的疫苗接种献血者已逐渐占献血主体地位,为提高输血安全,有必要深入研究和监测免疫压力下病毒突变株流行概况,分析其生物学特征。
位于HBV 亲水区(MHR,aa99-aa169)的逃逸突变在全世界范围内被广泛报道,例如阿根廷14.8%[6]、摩洛哥15%[7]、波兰15.4%[8]、伊朗14%~32.8%[9-11]、塞尔维亚22.6%[12]、法国27.8%[13]、韩国44.1%[14]等。MHR 突变能够带来一系列的诊断问题,还会导致隐匿性乙肝(OBI)、疫苗逃逸突变以及乙肝免疫球蛋白治疗无效[15-19]。病毒突变引起HBV 疫苗突破感染的机制包括:1)改变构象结构和/或T细胞表位结构,进而通过免疫系统使突变病毒逃避识别和清除;2)通过疏水情况和推定的糖基化位点的变化来改变HBsAg的抗原性,因而减少或消除对HBsAb的亲和力,导致保护减少[20]和HBsAb反应正常的患者感染不同基因型或亚型的HBV毒株;3)由于突变型在“a”决定区域内或周围,aa替代的积累可能会改变HBsAg的免疫性,产生对HBsAb的无效响应,使得突变病毒逃避清除、有着更长的生存期[21]。本研究发现63%的基因型B和50%基因型C在MHR 区间发生突变,远高于上述几个国家的报道,应引起高度重视和关注。
本研究中HBV 感染献血者HBV基因s126 和s129 上的突变主要为s T126S/N/I/A(5/46,10.87%)和s Q129H/R(6/46,13.04%),这2 种突变均被认为是免疫逃逸突变,仅在基因型为B的突变株上出现[18,22]。B基因型T126S/N/I/A 和C基因型I126S/T 突变型与免疫逃逸有关,其与单克隆抗体(MAbs)的结合将会受到影响[24]。有研究表明sQ129R会减少表面蛋白和病毒颗粒的分泌[24]。这一突变在HBsAg 和HBsAb 共存的慢性乙肝患者中被多次发现[25-27]。因此,在我国sT126S/N/I/A 和sQ129R 是B型突变株中重要的逃逸突变。s145 位置上的突变率约为2.3%,包括sG145R(2/46,4.35%),这种突变主要在C突变型中被发现,而本研究的标本发生在B基因型突变,应引起高度重视。sG145R 首次在1名乙肝患儿体内被发现,该名婴儿已有保护滴度的HBsAb[28],在后来的几十年中,sG145R 成为了被报道最多的疫苗逃逸突变[18,22,27-28]。研究发现,sG145R可以显著地减少病毒颗粒的分泌,还会减弱对乙肝表面抗原的检测[24]。同时,sG145R/A在不同的试剂检测中还会表现出不同程度的HBsAg结合改变[15,29]。另外针对B型和C型突变株的研究发现,sG145R/A与隐匿性乙肝(OBI)有关[18]。更重要的是,sG145R会随着时间的推移变得更加稳定,最终导致水平传播[18,30]。因此,表面基因的sG145R/A突变可能会在未来对“全球疫苗计划”造成威胁。
我国自1992年起实施了全面的乙肝疫苗接种计划,使15 周岁以下人群乙肝HBsAg 阳性率迅速由8%下降到0.8%~1.99%,同时在疫苗接种献血人群中抗-HBc 水平(20.8%)明显低于一般人群(42%~58%)[31-32],计划免疫后出生献血人群总体HBV 检出率(乙肝急慢性感染和OBI)也显著性低于计划免疫前出生献血人群[33]。本研究HBsAg 阳性率为0.13%,远低于同地区总献血人群中的确证比例0.5%[33],表明疫苗接种的确能降低输血感染乙肝风险。疫苗接种是否具有保护性主要是抗-HBs 滴度。本研究发现HBV 感染献血者中只有2 名抗-HBs+,滴度<20 IU/L,HBsAg 滴度<20 IU/mL,表明即使接种了疫苗,由于接种无反应或抗体滴度减弱,也会失去保护性。而男性HBsAg阳性率高于女性(P<0.05),性别差异是由一系列因素引起的,例如:基因、激素,以及细胞因子等[34]。
综上所述,目前高频率的HBV毒株突变,尤其免疫逃逸相关突变无疑对输血安全产生了很大威胁。对此,除大力普及乙肝相关性疾病的健康知识(如传播途径、防护手段),提高大众的防范意识,构建更加安全采供血体系外,还应该加强对病毒基因突变尤其免疫逃逸突变的监测和研究。