克癃胶囊对良性前列腺增生模型大鼠的作用机制研究*

宋冠慧,樊丹平,李 艳,刘 红,潘静华,王少君,孙 健,樊新荣△

(1. 中国中医科学院医学实验中心,北京 100700;2. 陕西中医药大学第一临床医学院,陕西咸阳 712046)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是引起中老年男性排尿障碍的常见泌尿男科疾病,据统计,BPH在中老年男性中发病率较高,极大地降低了患者的生活质量[1]。随着老龄化人口日益增多,罹患BPH的人数也在逐年增加,研究表明,40岁时30%～40%的男性患有BPH,而在80岁以上的男性中,BPH的发病率可增至70%～80%[2]。中医认为BPH属于“癃闭” “淋证”等范畴,其基本病机为本虚标实,中老年男性因肾气逐渐衰弱,导致肾阳亦虚,阳虚对血液的推动作用减弱,进一步出现瘀血内生,引起脉络瘀阻,故前列腺逐渐增生肥大。BPH在临床以尿频、尿失禁、进行性排尿困难为特征性表现,组织学方面主要表现为前列腺间质和腺体成分增生;解剖学方面主要表现为前列腺增大;尿动力学方面主要表现为膀胱出口梗阻和下尿路症状(lower urinary tract symptoms,LUTS)[3-4]。然而BPH的发病机制目前尚未完全明确。目前,雄性激素被认为与BPH的发生发展密切相关,其他因素如雌雄激素之间的平衡失调、组织缺氧、局部代谢紊乱、局部炎症等也与BPH发病有关[5]。近期研究表明,核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid2-related factor,Nrf)2介导的氧化应激是BPH发生发展相关连锁反应的机制之一[6]。

克癃胶囊是根据BPH的病因病机,在金匮肾气丸基础上增加黄芪、大豆异黄酮、南瓜子油等组成的化裁方。前期临床研究发现克癃胶囊能降低前列腺指数,明显抑制BPH[7];基础研究结果显示克癃胶囊能够降低BPH肾虚血瘀证模型大鼠的前列腺湿重和前列腺指数,改善前列腺组织的病理性增生。克癃胶囊还能降低BPH肾虚血瘀证模型大鼠血清酸性磷酸酶,调节卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体生成素(luteinizing hormone,LH)水平,抑制前列腺组织中由MKI-67基因编码的核蛋白(Ki-67)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)蛋白及VEGF mRNA的表达[8-9]。本研究在前期研究的基础上,进一步从Nrf2信号通路探讨克癃胶囊对BPH的作用机制,为克癃胶囊治疗BPH提供更多实验依据。本研究实验方案已通过中国中医科学院医学实验中心实验动物伦理委员会审查,批件编号:ERCCACMS21-2302-03。

1 材料

1.1 动物

6～8周龄雄性SD大鼠,体质量(200±10)g,购自中国食品药品检定研究院,动物许可证号:SCXK(京)2022-0002。所有大鼠饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所动物房,采用标准饲料分笼饲养,动物房温度20～25 ℃,湿度40%～60%,每日定时添加饲料及饮用水。

1.2 药物及试剂

克癃胶囊主要由熟地黄、山茱萸、茯苓、牡丹皮等药物组成。以上药物采用水提的方法制备后,在真空干燥箱中70 ℃减压干燥成干浸膏。非那雄胺(货号:J20150143),规格5 mg,杭州默沙东制药有限公司。98%丙酸睾酮(货号:T818615-5 g)、无菌橄榄油药用级(货号:O815211-500 mL),上海麦克林生化科技股份有限公司;苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)高清恒染套装(货号:BLGQ02-06),北京九州柏林生物科技有限公司;睾酮(testosterone,T)ELISA试剂盒(货号:EK6842)、二氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)ELISA试剂盒(货号:EK10707)、雌二醇(estradiol,E2)ELISA试剂盒(货号:EK10510),上海萨博科技生物有限公司;RNA提取试剂(货号:11141ES10)、逆转录试剂(货号:11141ES60),上海翌圣生物科技有限公司;Trizol试剂(货号:15596018),美国Invitrogen公司。

1.3 主要仪器

KD-BM型生物组织包埋机,浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;Finesse ME+型全自动石蜡切片机,美国Thermo公司;Model-3120059型漂片仪,美国Thermo公司;Model-20061型烤片机,美国Thermo公司;HSP-BE型恒温恒湿培养箱,湖南力辰仪器科技有限公司;Synergy H1型酶标仪,美国Bio Tek公司; NanoDrop One型超微量紫外分光光度计,美国Thermo公司;DM6000B型显微镜,美国Lecia公司;Archimed R4型荧光定量PCR仪,鲲鹏基因(北京)科技有限公司。

2 方法

2.1 BPH模型制备

60只雄性SD大鼠适应性喂养7 d后,按体质量随机分为正常组、假手术组和BPH造模组。参照前期方法,BPH造模组大鼠采用戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉后,经阴囊切除双侧睾丸[7-10]。术后第8天,造模组大鼠经背部皮下多个注射部位交替注射5 mg/kg丙酸睾酮(规格25 g/L,按1:4溶于无菌橄榄油),给药体积为1 mL/kg,连续注射28 d制备BPH模型。

假手术组大鼠手术方法同造模组,但仅暴露睾丸不予摘除。所有进行手术操作的大鼠,连续3 d肌注青霉素(80万单位/日),以预防伤口感染。造模组大鼠皮下注射丙酸睾酮时,假手术组大鼠仅注射无菌橄榄油,给药体积为1 mL/kg。所有大鼠均连续注射28 d。

2.2 分组与给药

术后第7 天,将造模组大鼠按体质量随机分为模型组、阳性对照(非那雄胺)组、克癃高剂量组、克癃中剂量组和克癃低剂量组,每组各8只大鼠。阳性对照组及克癃高、中、低剂量组大鼠予相应非那雄胺(0.45 mg/kg)和克癃胶囊(14.4 g/kg,7.2 g/kg,3.6 g/kg)灌胃给药。正常组、假手术组及模型组大鼠灌胃等体积的纯净水,均连续灌胃28 d。给药结束后,腹主动脉取血并分离血清,取前列腺组织于-80 ℃冰箱冻存备用。

2.3 HE染色

取各组大鼠部分前列腺组织,于4%多聚甲醛溶液中固定,随后进行石蜡包埋、切片、脱蜡和苏木素、伊红染色,光学显微镜下观察各组大鼠前列腺组织形态学结构的变化。

2.4 ELISA检测

严格按照试剂盒说明书进行操作,测定各组大鼠血清样本中T、E2、DHT的表达水平。

2.5 实时荧光定量PCR检测

取出冻存的前列腺组织,Trizol法提取总RNA,逆转录试剂盒反转录成cDNA后,进行PCR扩增。采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。引物Nrf2、NQO1、TNF-α、IL-1β、IL-6和GAPDH由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,见表1。

表1 引物序列表

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 克癃胶囊对BPH模型大鼠前列腺组织病理的影响

HE染色结果可见,与正常对照组和假手术组比较,模型组大鼠腺上皮呈立方状或高柱状,腺腔明显扩张,腔内分泌物明显增加;阳性对照组和克癃高剂量组大鼠腺上皮多呈立方状,高柱状腺上皮的数量减少,前列腺腺腔扩张明显改善,见图1。

图1 克癃胶囊对前列腺增生(BPH)模型大鼠前列腺组织病理变化的影响(HE×50)

3.2 克癃胶囊对BPH模型大鼠血清中T、E2和DHT水平的影响

ELISA结果显示,正常组与假手术组大鼠比较血清中T、E2和DHT的表达差异均未见统计学意义。与假手术组比较,模型组大鼠血清中T和DHT表达明显升高(P<0.05),E2表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,克癃高、中剂量组大鼠血清T和DHT表达均显著降低(P<0.05),E2表达明显上调(P<0.05),克癃低剂量组大鼠血清T,DHT和E2表达水平差异均未见统计学意义,见图2。

注:与假手术组比较#P<0.05,##P<0.01;与模型组比较*P<0.05,*P<0.01;睾酮(T),雌二醇(E2),二氢睾酮(DHT)图2 克癃胶囊对前列腺增生(BPH)模型大鼠血清中T、E2和DHT含量的影响(n=8)

3.3 克癃胶囊对BPH模型大鼠前列腺组织中Nrf2和NQO1 mRNA水平的影响

实时荧光定量PCR结果显示,正常组与假手术组比较大鼠前列腺组织中Nrf2和NQO1 的mRNA水平差异未见统计学意义。与假手术组比较,模型组大鼠前列腺组织中Nrf2和NQO1的mRNA表达水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,克癃胶囊高、中剂量组大鼠前列腺组织NQO1 mRNA水平显著升高(P<0.01),克癃胶囊高、中、低剂量组大鼠前列腺组织中Nrf2 mRNA水平均显著升高(P<0.05),见图3。

注:与假手术组比较##P<0.01;与模型组比较*P<0.05,*P<0.01;核因子E2相关因子2(Nrf2),醌氧化还原酶(NQO1)图3 克癃胶囊对前列腺增生(BPH)模型大鼠前列腺组织中Nrf2和NQO1mRNA表达水平的影响(n=8)

3.4 克癃胶囊对BPH模型大鼠前列腺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平的影响

实时荧光定量PCR结果显示,正常组与假手术组大鼠比较前列腺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6 的mRNA表达水平差异均未见统计学意义。与假手术组比较,模型组大鼠前列腺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,克癃高、中、低剂量组大鼠前列腺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平均显著降低(P<0.05),见图4。

注:与假手术组比较##P<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01;肿瘤坏死因子(TNF),白细胞介素(IL)图4 克癃胶囊对前列腺增生(BPH)模型大鼠前列腺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平的影响(n=8)

4 讨论

BPH以尿频、尿失禁、进行性排尿困难为特征性表现。随着我国人口老龄化趋势的加重,BPH及相关的LUTS已经严重影响了老年男性的身心健康和生活质量。

目前学者普遍认为雄性激素与BPH的发生发展密切相关,其他因素如间质-上皮转化、组织缺氧、细胞增殖/凋亡失衡、局部代谢紊乱等也与BPH相关[5]。中医学认为BPH主要的病机为肾虚血瘀,所以益肾阳和通瘀血是其根本治疗原则。克癃胶囊是根据BPH的病因病机,基于“阳化气,阴成形”“气虚乃阳虚之渐,阳虚乃气虚之甚”及“截断扭转”理论,在金匮肾气丸基础上增加了黄芪、大豆异黄酮、南瓜子油等组成的化裁方[7]。前期临床研究已经证实,克癃胶囊可以降低BPH患者的前列腺症状评分,使BPH患者增大的前列腺体积减小,增加患者的最大尿流率,减少患者的剩余尿量[7]。在本实验研究中,克癃胶囊高剂量可明显改善BPH模型大鼠前列腺组织中前列腺腺腔扩张,减少高柱状腺上皮的数量。激素水平方面,克癃胶囊可以抑制BPH模型大鼠血清中T和DHT的表达,升高E2的表达水平。

作为抗氧化应激和外源性损伤重要的细胞防御机制之一[11],Nrf2/抗氧化反应元件(antioxidative-responsive elements,ARE)通路能够调节细胞抗氧化酶基因的转录,维持氧化还原平衡[12]。在正常生理状态下,Nrf2与其阻遏物KELCH样ECH关联蛋白(Kelch Like ECH associated protein,KEAP)1重组蛋白结合,致使Nrf2泛素化,与活性氧形成动态平衡。而在氧化应激期间,Nrf2与KEAP1解离,游离的和新合成的Nrf2转运进入细胞核,激活下游ARE依赖性基因的表达,包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、血红素氧合酶(hemeoxygenase,HO)-1和醌氧化还原酶[nad (ph) quinone oxidoreductase,NQO]1等[12]。除了抵抗氧化应激反应,Nrf2的激活还可抑制机体的炎症反应。Eri H等发现Nrf2通路的激活通过抑制小鼠炎症模型中促炎细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-6基因转录的诱导,减轻了炎症表型。Nrf2的激活也可防止脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的促炎细胞因子(包括IL-6和IL-1β)的转录上调[13]。研究表明,Nrf2介导的氧化应激是BPH发生发展相关连锁反应的机制之一[6]。有研究发现,氧化应激介导和诱发的脂质过氧化及细胞增殖会诱导细胞突变和增殖分化,这会导致前列腺细胞的异常增殖与重塑,最终引起BPH的发生发展[14]。Pace等[14]发现BPH患者体内的抗氧化酶活性显著降低,氧化应激和DNA损伤水平明显升高,提示氧化损伤会导致BPH的发生发展。本研究发现,BPH模型大鼠前列腺组织中Nrf2和NQO1的mRNA表达水平显著降低,说明BPH模型大鼠的抗氧化应激能力受到抑制,而克癃胶囊能够使BPH模型大鼠前列腺组织中Nrf2和NQO1的mRNA表达水平上调,这可能是克癃胶囊治疗BPH另外一个潜在机制。

同时有研究发现:大多数BPH患者的前列腺组织中均有一定程度的炎细胞浸润,说明前列腺慢性炎症参与了BPH的发展,有相关研究发现慢性炎症引起前列腺局部组织代偿性细胞增殖,进而打破细胞增殖和凋亡之间的平衡[15-16]。前列腺增生组织内的炎症也可以促进血管新生,从而促使前列腺增生。在一项纳入8 224名BPH患者的临床研究中,经组织活检,研究者发现超过70 %的BPH患者合并增生组织的慢性炎症,且这些患者的国际前列腺症状评分(international prostate syptom score,IPSS)和前列腺体积显著高于或大于非炎症组BPH患者[17]。另一项纳入4 109名BPH患者的研究发现,前列腺组织的慢性炎症与较高基线的IPSS评分及较大的前列腺体积相关,相较于前列腺组织无炎症的BPH患者,存在慢性炎症的BPH患者被证明有更大的前列腺体积,更严重的LUTS以及更高的急性尿潴留风险[18]。一项BPH的临床研究发现:非甾体类消炎药可以缓解BPH患者的临床症状,这提示开发具有抗炎作用的新型药物可能是治疗BPH的新方向[19]。以上研究表明前列腺慢性炎症与BPH发展存在较强的正相关性,但慢性炎症参与BPH发展的机制尚未明确。在本研究中,BPH模型大鼠前列腺组织中炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA水平明显升高,这可能是慢性炎症参与BPH发展的机制之一,克癃胶囊则可以降低BPH模型大鼠前列腺组织中炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6的mRNA水平,达到抑制炎症的作用。

综上所述,克癃胶囊作为一种中药复方制剂,可以通过促进抗氧化应激因子的表达,并抑制炎症因子的表达,最终达到治疗BPH的效果,验证了克癃胶囊治疗BPH的疗效和可能的作用机制,为克癃胶囊治疗BPH提供了进一步的实验依据。