福建黄果西番莲果腐病菌分离鉴定及其生物学特性

林育钊,陈月莉,蒋璇靓,郑金水,陈洪彬

(1 泉州师范学院海洋与食品学院,福建泉州,362000;2 福建省泉州市农业科学研究所,福建泉州,362212)

西番莲PassifloracaeruleaL.,又称百香果,是热带亚热带特色水果,在我国南方广泛种植,主要分布在福建、广西、广东、台湾等省(区)[1-4]。西番莲果实含有多种营养物质,如酚类、氨基酸、糖类、酯类、醇类、矿物质等,具有较好营养价值,深受消费者喜爱[1,5-6]。目前,市场上黄果与紫果西番莲果实销售量较大,相比于紫果西番莲果实,黄果西番莲果实营养价值更高[7]。西番莲果实采后常温贮藏中易发生果皮失水皱缩现象,并伴随果皮褐化和腐烂病斑,不利于果实采后贮藏保鲜,极大地缩短了果实货架期[2-3,7-8]。茎基腐病、叶斑病、炭疽病、疫病、顶枯病等是西番莲常见病害,对西番莲产业造成严重危害[1,8-10]。近年来,我国广西、广东等地区西番莲果实出现由可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae引起的果腐新型病害[11-12],即在侵染初期,发病部位出现浅褐色病斑,果皮凹陷;病害症状随侵染进程而不断扩大直至蔓延全果,导致果实腐烂[12]。笔者从福建省南安市种植的黄果西番莲果实中也发现果腐病,发病症状与前人研究报道类似。Zhang等[11]从采后西番莲果腐病果分离病原菌,并鉴定为L.theobromae,但未探究该病原菌生物学特性,也未提及发生果腐病的是黄果还是紫果果实,不利于黄果西番莲采后果腐病防治。目前鲜见关于福建省黄果西番莲果腐病菌的研究报道,因此本研究拟从病原菌分离鉴定等方面着手研究,以确定福建省黄果西番莲果腐病菌,初步研究其生物学特性,以期为防治黄果西番莲果腐病,稳定果实品质,推动产业健康发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

果实材料:采收福建省南安市溪美镇宣化村缘味家庭农场“福建百香果3号”(PassifloracaeruleaL. cv. Fujian passion No. 3)黄金西番莲九成熟果实,运回实验室,挑取色泽均匀、大小和成熟度一致,无病虫害,无损伤果实备用。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基,购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 果腐病菌分离和形态鉴定

1.2.1 分离和纯化

参照陈蓬莲等[13]的方法,采用组织分离法,对果腐病果果皮病健交界处用75%乙醇消毒,取边长3 mm正方形组织块,放于乙醇中浸泡30 s,随后取出用无菌水清洗3次,无菌滤纸干燥,接种至含有链霉素100 μg/mL的PDA平板(直径90 mm)上,放置于28 ℃条件下培养,当菌落直径达到3 cm时,用无菌接种针取出边缘菌丝转接至新的PDA平板上,重复4次纯化菌株,命名为B3。

1.2.2 致病性测定和形态鉴定

参照陈蓬莲等[13]与Chen等[14]的方法,采用柯赫氏法则验证菌株B3,将直径5 mm 菌株B3菌丝块接种到已经过酒精消毒、无菌水清洗、晾干处理的健康果实表面(损伤接种),以接种灭菌PDA培养基块为对照,随后装袋于28 ℃条件下培养;待果实发病后,从病样分离病原菌,与接种菌株对比;再把分离菌株接种于PDA平板上,28 ℃下培养,从菌株菌落特征、分生孢子形态等初步判定其种类。

1.3 分子生物学鉴定

1.3.1 菌株DNA提取

28 ℃下培养菌株B3至菌丝长满整个PDA平板,用无菌药勺取菌丝体,无菌水清洗3遍,无菌滤纸干燥,在液氮中研磨后移到1.5 mL离心管,采用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株B3的基因组DNA。

1.3.2 菌株ITS区PCR扩增及测序

参照Jamali[15]的方法,使用真菌通用引物ITS-1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、ITS-4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR扩增。目的产物片段纯化、回收都使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒,最后由青岛亿信检测技术服务有限公司完成产物测序。

1.3.3 序列比对与系统发育树建立

在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中,使用BLAST分析工具以获得与菌株B3亲缘性最接近的其他菌株的ITS序列,再使用MEGA 11.0软件,采用邻接法构建系统发育树,用Bootstraps法(重复1 000次)检验。

1.4 病菌生物学特性测定

1.4.1 温度的影响

参照张居念等[16]、陈南泉等[17]的方法,把菌株B3直径5 mm菌丝块(1.4.2—1.4.4同)接种在PDA平板上,分别放置在19、22、25、28、31和34 ℃下恒温培养,相对湿度90%,48 h后采用十字交叉法测定菌落直径(1.4.2—1.4.4同)。

1.4.2 pH值的影响

用1.0 mol/L HCl或NaOH调节灭菌的PDA培养基pH值,使得pH值分别达到4、5、6、7、8、9、10和11,把菌株B3菌丝块分别接种在不同pH值PDA平板,相对湿度90%,28 ℃恒温培养,48 h后测定菌落直径。

1.4.3 碳源的影响

用Czapek固体培养基为基础培养基,可溶性淀粉、D-果糖和葡萄糖等质量碳素替换其中的蔗糖,制成不同碳源培养基,不含蔗糖培养基为对照,把菌株B3菌丝块接种至不同碳源培养基平板上,相对湿度90%,28 ℃恒温培养,48 h后测定菌落直径。

1.4.4 氮源的影响

以Czapek固体培养基作为基础培养基,蛋白胨、硝酸钾等质量氮素替换其中的硝酸钠,制成不同氮源培养基,不含硝酸钠培养基为对照,把菌株B3菌丝块接种在不同碳源培养基平板上,相对湿度90%,28 ℃恒温培养,48 h后测定菌落直径。

1.5 数据处理

生物学特性测定均重复3次,结果以平均值±标准误表示。采用软件SPSS 22.0进行数据分析,用Duncan’s进行差异多重比较,p<0.01和p<0.05分别表示差异达极显著或显著水平。

2 结果与分析

2.1 西番莲果实采后果腐病症状

由图1可知,黄金西番莲果实刚采收时,果皮黄绿色,采收果实25 ℃,相对湿度85%下贮藏,随着贮藏时间延长,果实逐渐转黄;贮藏12 d时,果实开始发生果腐病,果皮发病部位出现浅褐色斑点伴随凹陷现象,有白色菌丝出现;随着病害加剧发生,贮藏18 d,病斑颜色转为黑褐色,且面积增大,灰白色菌丝增多,病斑周边黄褐色变深,果皮变软塌陷、腐烂、变薄,全果出现软腐症状。

图1 黄金西番莲果实采后果腐病症状

2.2 果腐病菌致病性和形态鉴定

由图2可知,健康黄金西番莲果实果皮表面接种菌株B3菌丝块后2 d,接种处出现浅褐色病圈;接种后3 d,接种处病圈扩大,呈黄褐色,出现凹陷现象,伴有白色菌丝;接种后5 d,接种处黑褐色,凹陷面积较大,果实褶皱,腐烂加剧,菌丝大量生长、呈灰白色,此时果实出现腐臭气味。接种菌株B3的果实发病症状与果实自然发病症状一致。

图2 黄金西番莲果腐病菌致病性测定、PDA平板上培养形态和分生孢子

从接种菌株B3的果实再分离病原菌,接种在PDA平板上,其菌丝、菌落形态、分生孢子与自然病果分离所得菌株B3一致。菌株B3在PDA平板培养时,菌丝迅速生长,呈白色放射状;2 d后基本长满整个平板,气生菌丝浓密,逐渐变为灰白色;培养7 d菌落较厚,菌丝灰黑色。显微镜下观察菌株B3分生孢子为茶褐色单孢,球形或椭圆形,表面光滑,大小约(15.56～23.04) μm×(13.28～17.61) μm。根据菌株B3菌落、分生孢子等特征,初步判定为可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae。

2.3 果腐病菌分子生物学鉴定

用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上BLAST工具搜索与菌株B3序列(登录号为OQ087002)相似的rDNA-ITS序列,而后比对与分析发现,菌株B3与相关属内参比菌株的rDNA-ITS序列的相似度为99%,推断菌株B3是可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae(见图3),与病菌形态鉴定一致。因此,分离获得的菌株B3为可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae。

图3 黄金西番莲果腐病菌B3系统发育树

2.4 病菌生物学特性

由表1可知,菌株B3在pH值4～11下均能生长。其中,pH值6时菌落直径最大,为(82.07±1.84) mm,显著(p<0.05)高于pH值4、7、10处理,极显著(p<0.01)高于pH值5、8、9、11处理。说明菌株B3菌落生长最适宜pH值为6。

表1 不同培养条件对黄金西番莲果腐病菌Lasiodiplodia theobromae菌落生长的影响

菌株B3菌落直径在19～28 ℃下培养快速增大,28～34 ℃菌落直径减小。28 ℃培养时,菌落生长速度最快,培养48 h菌落直径为(89.32±0.66) mm,极显著(p<0.01)高于19、22、34 ℃下培养的菌落直径,显著(p<0.05)高于25和31 ℃下培养的菌落直径。说明28 ℃为菌株B3菌落生长最适温度。

菌株B3在供试碳源培养基均能生长,其菌落直径都大于对照(无碳源)。葡萄糖为碳源的培养基上,菌株B3菌落直径最大,为(71.70±2.63) mm,极显著(p<0.01)高于其他碳源培养基,说明葡萄糖为最适宜碳源。

菌株B3在供试氮源培养基均能生长,且菌落直径均高于对照(无氮源)。其中,硝酸钾为氮源培养基上,菌株B3菌落直径最大,为(57.39±2.05) mm,极显著(p<0.01)高于蛋白胨为氮源培养基,显著(p<0.05)高于硝酸钠为氮源培养基,说明硝酸钾为最适氮源。

3 结论与讨论

可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae是热带亚热带地区分布较为广泛的病原菌,能够导致多种植物病害,可引起植物根腐病[18-19]、流胶病[20]、叶斑病[21]等病害,进而导致植物腐烂。笔者从福建黄金西番莲果腐病果分离纯化病菌菌株B3,经过致病性测定、形态学与分子生物学鉴定为可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae,说明引起福建黄金西番莲果实采后果腐病的病原菌为L.theobromae。与前人研究结果比较发现,L.theobromae引起的不同植物病害症状不一致。L.theobromae是导致桑和槟榔发生根腐病的主要病原菌[18-19],橡胶树叶斑病可由L.theobromae侵染引起[21];张居念等[22-23]研究报道,龙眼果实采后焦腐病病原菌为L.theobromae。关于L.theobromae侵染源与侵染时期等仍需进一步研究。

对菌株B3L.theobromae的生物学特性初步研究发现,28 ℃、6、葡萄糖、硝酸钾分别是其菌落生长最适温度、pH值、碳源和氮源。与张居念等[23]报道的龙眼L.theobromae菌落生长最适温度28～30 ℃,pH值6～7,最适碳源蔗糖和葡萄糖相似。西番莲L.theobromae菌落生长最适pH值与刘树森等[24]研究结果一致,最适温度存在一定差异。西番莲L.theobromae菌落生长最适碳源与戴利铭等报道一致,而最适pH值存在一定差异[21]。杜婵娟等[25]对广西西番莲果腐病菌(L.theobromae)生物学特性研究发现,菌丝最适生长温度、pH值、氮源分别是31～34 ℃、4.5～5.5、硫酸铵和氯化铵,与本研究结果不一致,存在较大差异。由此可知,不同区域西番莲果实采后果腐病菌生物学特性存在差异,这可能与不同地区不同土壤栽培环境、气候条件等有关,因而西番莲果腐病防控应根据不同地区发生特点进行调整。本研究仅对L.theobromae部分生物学特性进行初步研究,仍需进一步研究其他生物学特性,以为防控黄金西番莲果实采后果腐病提供有力理论支撑。