自动化磁珠法提取血清脂溶性维生素应用LC-MS/MS检测的性能评价

孔 卓，李春艳（北京积水潭医院医学检验中心，北京 100035）

脂溶性维生素是体内的辅酶和催化剂，主要溶解于脂肪，储存于肝脏，对人体的生长发育、免疫、应激等均有重要作用。脂溶性维生素缺乏会引起人体生理机能、新陈代谢、细胞调节紊乱，诱发多种疾病，而摄入过量则易引起蓄积中毒，甚至导致死亡[1-2]。因此，监测人体内脂溶性维生素的浓度非常必要，有助于人体健康的评价、疾病的诊断以及治疗过程中摄入量的控制，临床意义重大。液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tarndem mass spectromerry,LC-MS/MS）技术以其高灵敏度、高特异度的强大优势，被广泛应用于临床检验领域，且在维生素、单胺类神经递质、激素等项目的检测中备受青睐。目前临床采用质谱技术检测脂溶性维生素的过程中，大多是通过手工操作完成样本提取，以萃取法居多，需浓缩、正压、多次离心等[3-6]，自动化程度极低，对操作人员技能要求较高，容易出现假阳性结果。自动化磁珠法样本制备前处理简单，自动化程度较高，极大程度地降低了人为因素，节约了人力和时间成本，并且有望将液相色谱-串联质谱技术发展成为前处理和检测一体的全自动分析仪。故本研究拟采用磁珠法进行样本前处理，联合液相色谱串联质谱检测人血清中脂溶性维生素含量，并与传统萃取法检测结果作为对照，评估该检测程序的分析性能，为临床脂溶性维生素样本检测自动化前处理的方法选择提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集当天临床检测剩余血清样本，选取非乳糜、黄疸的200 例样本分装后保存于-80℃备用。本研究经过医院伦理委员会审核批准后实施。

1.2 仪器与试剂 液相色谱串联质谱系统（美国Waters Xevo TQ-S IVD）；ZPTQ 32 自动化磁珠法质谱全自动样品处理系统（北京梅斯质谱生物科技有限责任公司）；BY-R20 型高速冷冻离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；MTV-100 多管涡旋混合仪和MB100-2A 微孔板恒温振荡器（杭州奥盛仪器有限公司）；传统萃取法脂溶性维生素测定试剂盒（杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司）；自动化磁珠法脂溶性维生素测定试剂盒（北京梅斯质谱生物科技有限责任公司）。维生素A 质控品：90，432，864 ng/ml；25-维生素D2质控品：3，14.4，28.8 ng/ml；25-维生素D3质控品：7.5，36，72 ng/ml；维生素E 质控品：1 725，8 280，16 560 ng/ml；维生素K 质控品：0.3，1.44，2.88 ng/ml。

1.3 方法

1.3.1 自动化磁珠法样本制备：按照试剂盒操作说明操作，将100 μl 血清样本加入预设的96 孔中的样本位置，再将同位素内标加入其中，后将96 孔板转移至前处理系统ZPTQ 32 仪器中进行自动化样本提取。标线、质控和样本同步操作处理。

1.3.2 传统萃取法样本制备：按照试剂盒操作说明操作，取50 μl 血清样本，加入250 μl 脂溶性维生素萃取液（含内标），涡旋8 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液200 μl 待测。标线、质控和样本同步操作处理。

1.3.3 色谱条件：色谱柱为 Kinetex 2.6 μm C18 100A 30×2.1 mm，流动相为0.1%甲酸水（A）～ 0.1%甲酸甲醇（B），梯度洗脱：0～ 0.5 min，40%流动相A；0.5～ 2 min，40%～ 0%流动相A；2～ 3.5 min，0%流动相A；3.51～ 5 min，40%流动相A；流速0.5 ml/min；柱温40 ℃，进样量10 μl。

1.3.4 质谱条件：采用正离子电喷雾离子化多反应监测模式（MRM），离子源温度 150℃，毛细管电压 3.5 kV，脱溶剂气和辅助气为氮气，脱溶剂气（氮气）体积流量 800 L/h，脱溶剂气温度 600℃，其他主要参数见表1。

表1 脂溶性维生素的相关质谱参数

1.3.5 性能验证：性能验证过程参考《液相色谱-质谱临床应用建议》[7]和《液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证》[8]两部专家共识。

1.3.5.1 线性、定量限和检测限评价指标 以标准溶液的浓度为X轴，标准品和内标峰面积的比值为Y轴，进行线性回归分析，经“1/X2”权重得到线性回归方程，且r2＞0.99。将血清样本中各物质峰面积和其内标的峰面积比值代入线性回归方程，计算样本中脂溶性维生素A，D2，D3，E，K 的含量。检测限为信噪比≥3 时的浓度，定量限为信噪比≥10 时的浓度，且连续10 次测定的变异偏差应＜20%。

1.3.5.2 精密度评价方案：混合血清样本平均分为2份，1份加入适量低浓度混合标准品作为低值样本，1 份加入适量高浓度混合标准品作为高值样本，混匀后分别分装保存于-80 ℃冰箱。每天各取出1 支，制备8 个平行管，测定三个批次，计算精密度，批内精密度和批间精密度的相对偏差应≤±15%。

1.3.5.3 正确度评价方案：通过加标回收率判断测定准确度，混合血清、混合血清添加脂溶性维生素A，D2，D3，E，K 两个水平的混合标准品溶液各10 μl，按上述前处理方法处理，各制备3 个平行管，计算加样回收率和测量偏差，加样回收率的相对偏差应≤±15%。

1.3.5.4 基质效应评价方案：采用样本处理后加入法。取8 份来源于不同个体的血清样本，每份样本分为3份，经过自动磁珠法提取后，一份加入水空白，一份加入10 μl 脂溶性维生素高浓度混合标准品，最后一份加入10 μl 脂溶性维生素低浓度混合标准品，3 份均加入20 μl 混合内标。去除空白样本的信号值后与溶剂中标准品峰面积（或峰面积比值）进行比较，判断基质效应，基质效应的相对偏差应≤±15%。

1.3.5.5 携带污染评价方案：选择高值质控和低值质控样本作为实验对象，分别进行高-低质控进样循环5 次和低-低质控进行循环5 次，高-低值样本循环进样结果均值与低-低值样本循环进样结果均值之差应小于低-低值样本循环进样结果均值的3s。

1.4 统计学分析 两种前处理方法提取并检测，检测结果使用MedCalc®20.0.27（比利时MedCalc Software bvba 公司）软件进行统计学分析。采用Bland-Altman 法比较两种前处理方法结果的一致性，通过Passing-Bablok 回归分析两种前处理方法结果之间的相关性。

2 结果

2.1 血清样本经自动化磁珠法提取脂溶性维生素后检测得到的各色谱峰 峰形对称，峰形良好互不干扰；与传统萃取法提取后的检测结果比较，未发现自动化磁珠法提取后的杂峰有明显增多。

2.2 自动化磁珠法提取脂溶性维生素性能评价结果2.2.1 线性、定量限和检测限：脂溶性维生素A，D2，D3，E，K 在标准曲线范围内相关性良好，各批次的相关系数均在0.99 以上，定量限和检测限满足要求，相关具体参数见表2。

表2 磁珠法提取脂溶性维生素LC-MS/MS 检测的回归方程、相关系数、线性范围、定量限及检出限

2.2.2 精密度和正确度：见表3。脂溶性维生素A，D2，D3，E，K 的低值样本和高值样本批内精密度分别在0.66%～4.83%，0.15%～3.70%；批间精密度分别在1.16%～4.33%，2.44%～6.61%，加标回收率在87%～112%，百分偏差均在±15%以内，满足检测要求。

表3 磁珠法提取脂溶性维生素LC-MS/MS 检测的精密度和正确度

2.2.3 基质效应和携带污染：见表4。脂溶性维生素A，D2，D3，E，K 在电喷雾离子源检测下几乎没有基质抑制，经同位素内标校正，基质效应均在100%左右；高-低值样本循环进样结果均值与低-低值样本循环进样结果均值之差均小于低-低值样本循环进样结果均值的3s，满足检测要求。

表4 磁珠法提取脂溶性维生素LC-MS/MS 检测的基质效应和携带污染

2.2.4 方法比对：见表5。对自动化磁珠法和传统萃取法两种方法提取200 例临床血清样本中脂溶性维生素的测定结果进行Bland-Altman 和Passing-Bablok 回归分析。Bland-Altman 分析结果显示所有样本均在±1.96s，表明两种提取方法检测结果具有较高的一致性，Passing-Bablok 回归分析结果显示两种提取方法的检测结果相关性良好（均r＞0.99，95% CI 均在0.986～0.997 之间）。

表5 两种方法提取临床血清样本中脂溶性维生素的测定结果比较

3 讨论

脂溶性维生素是人体内不可或缺的一类营养物质，缺乏或过量均会对身体机能造成损伤，诱发多种疾病[3,5]。人体缺乏维生素A，会引起儿童发育不良、皮肤干燥、干眼病、夜盲症等；缺乏维生素D 可能会导致儿童佝偻病、成人骨质疏松症、软骨症、肌无力，增加老年人跌倒和骨折的风险；维生素E 与肌肉、神经、生殖有关，摄入不足可能产生运动失调、毛发脱落、不育等症状；维生素K 又叫凝血维生素，缺乏可能致凝血时间延长，严重时危及生命[9]。但是补充过量的脂溶性维生素同样会导致不良事件的发生，维生素A 补充过量可引起维生素A 过多症、牙龈出血，甚至出现急性或慢性中毒；维生素D 补充过量则可能会导致血钙浓度过高，引起钙盐在肾脏、肺脏、神经系统和心血管系统等重要器官和组织的沉积钙化，产生不可逆的严重损害；长期服用较大剂量的维生素E 有可能出现肌无力、疲倦、头痛和恶心等中毒症状，维生素E 过量还可能引起大出血；过量补充维生素K 会导致人体发生癌症和出现皮疹的现象，孕妇服用大剂量维生素K有可能造成新生儿黄疸。综上所述，对于儿童以及孕妇等特殊人群，准确检测脂溶性维生素尤为重要。

儿童由于受关注度高、年龄小、描述病情能力弱等特点，在儿科临床诊疗工作中，许多家长以及一些临床医生对儿童是否要补充维生素、是否需要持续补充以及担心维生素过量或中毒等方面常常存在困惑。脂溶性维生素谱检测为指导临床上维生素科学合理补充提供有力的参考依据。对于高代谢水平的孕产妇而言，维生素缺乏或过量均会造成不理想的妊娠结局，有研究表明，维生素D 与维生素D受体结合后可参与胚胎着床、妊娠相关蛋白和细胞因子的分泌及钙的输送，在维持正常妊娠和胎儿发育中发挥着重要作用[10]。由于孕妇及家属对维生素的认知不足，只是单纯认为补充维生素D 就够了，忽视了维生素A，E，K 的意义，导致妊娠期、围产期以及新生儿发育期间产生不同程度的危害。故建议提高医生及孕妇对合理补充维生素的重视程度，加强宣传和引导，使孕期维生素营养检测成为常规，根据孕妇自身需要制定个体化补充方案，避免因补充不当造成孕产妇及围生儿隐匿性不良结局。因此，对人体内脂溶性维生素含量的检测是非常必要的。

目前临床常用的方法主要集中在免疫法、色谱法和质谱法，各有优劣。免疫法虽操作简单，但无法精准区分VD2，VD3，只能测VD 总含量，且不可同时检测多种脂溶性维生素[3]；色谱法可精准区分VD2，VD3，也可同时检测多种脂溶性维生素，但其灵敏度不高，且操作复杂[11-13]；常见的质谱法虽然灵敏度高，但其前处理的方法包括固相萃取、液液萃取及蛋白沉淀等，均存在各自不足，如蛋白沉淀的方式简单、成本低，但是处理粗糙，对仪器、色谱柱污染较大，且易出现离子抑制导致检测灵敏度较差，一般仅适用于含量较高的药物浓度监测；液液萃取的方式成本较低，但是使用挥发性溶剂较多，且需经过离心、取上清、氮吹等较为繁琐的步骤，仅适用于脂溶性维生素、脂肪酸等中等极性或弱极性物质的提取；若是含量较低的代谢物或激素类物质需使用固相萃取法，该方法能有效提取浓缩待测物，但成本较高，还需多次离心、浓缩等复杂过程，对操作人员要求较高，自动化程度极低，容易造成假阳性结果[3-5]。

本研究采用的磁珠法是通过在磁珠表面进行化学基团修饰，使待测物与磁珠表面键合相发生吸附解吸附的过程（模拟固相萃取），将活化平衡后的磁珠加入待测样本中，充分混匀，使待测物被吸附在磁珠上，再通过不同极性强度的洗脱溶液洗脱，以达到待测物的分离和纯化[14-15]。与传统固相萃取法相比，磁珠法通过磁珠的转移来实现目标待测物的分离，不仅操作简单、自动化程度较高，且未来有望实现前处理和检测分析一体的全自动液相色谱-串联质谱设备。

综上，自动化磁珠法样本制备联合液相色谱串联质谱检测人血清中脂溶性维生素的检测性能稳定，满足相关指南及临床检测要求。磁珠法在未来有望实现大规模化应用于临床质谱检测的自动化前处理过程，提高检测效率和精度，方便临床检验应用。