肝细胞肝癌患者血清LG2m和hPG80表达水平及临床价值研究

刘 宏,张春华,阳 宏,王万琴（成都市双流区第一人民医院/四川大学华西空港医院消化内科，成都 610200）

肝癌(liver cancer)是常见的消化系统恶性肿瘤，全球每年有100 万新发病例，死亡达74 万例[1]。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌最常见的病理类型。目前HCC 的治疗以手术、化疗、靶向治疗及免疫治疗等综合治疗为主，但HCC 易复发和转移，患者预后不佳[2]。层黏连蛋白γ2 单体(laminin gamma 2 monomer,LG2m)是层黏连蛋白的多肽链组成成分，参与细胞黏附、分化、增殖和迁移等生理过程。研究发现，LG2m 在膀胱癌、卵巢癌等[3-4]恶性肿瘤中表达上调，能促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，是新的评估肿瘤患者预后的生物标志物。人循环前胃泌素（human circulating gastrin，hPG80）是胃窦G 细胞合成的胃泌素前体。研究发现，神经内分泌癌、肾细胞癌等恶性肿瘤中hPG80表达升高，其能促进肿瘤的增殖及侵袭，导致患者不良预后。目前，HCC 患者血清LG2m，hPG80 表达及临床意义尚不清楚。本研究通过检测HCC 患者血清LG2m 和hPG80 水平，探讨两者的临床意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2016年1月～2018年1月成都市双流区第一人民医院收治的128 例HCC 患者作为HCC 组。纳入标准：①均接受根治性或姑息性肝切除术，术后病理明确为HCC；②首次诊治；③临床及病理资料完整；④患者及家属已签署知情同意书。排除标准：①并发胆管细胞癌或混合细胞型肝癌；②并发急性病毒性肝炎、肝脓肿等感染性疾病；③并发其它系统恶性肿瘤；④并发胃炎、胃溃疡及胃泌素瘤等疾病；⑤并发类风湿关节炎等免疫性疾病。HCC 组中，男性70 例，女性58 例；年龄29～78(63.18±8.25)岁；肿瘤直径≤5 cm者52 例，＞5 cm 者76 例；TNM 分期I～Ⅱ期67例，Ⅲ期61 例；肿瘤分化程度：低分化55 例，高中分化73 例；血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）＜400 μg/L 58 例，≥400 μg/L 70 例；并发乙肝病毒感染（hepatitis B virus，HBV）78 例；脉管浸润39 例。以同期诊治的70 例肝脏良性病变患者为良性病变组。其中男性40 例，女性30 例；年龄27～79(64.02±8.17)岁；肝囊肿33 例，肝脏局灶性结节性增生24 例，肝脏血管平滑肌脂肪瘤13 例。以同期体检的70 例健康人为对照组，其中男性37 例，女性33 例；年龄25～80(63.52±7.97)岁。三组患者性别、年龄差异无统计学意义(χ2/t=0.110，0.061，0.260；0.687，0.281，0.367，均P＞0.05)。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 LG2m 试剂盒（重庆智选生物科技有限公司，货号ZX15987）；hPG80 试剂盒（武汉菲恩生物科技有限公司，货号EH4077）；imark 酶标仪（美国伯乐公司）。

1.3 方法

1.3.1 检测方法：采集HCC 组和良性病变组患者入院次日清晨空腹及对照组体检当日清晨空腹静脉血5ml，3 500 r/min 离心30 min，分离血清。采用酶联免疫吸附实验（双抗体夹心法）检测血清LG2m 和hPG80 水平。实验步骤按照试剂盒说明书进行，根据标准品绘制标准曲线，计算样品的浓度值。

1.3.2 随访：HCC 患者出院后采用门诊或电话进行随访，第1年每3 个月随访1 次，第2年每6 个月随访1 次，第3～5年每年随访1 次。记录患者生存时间。随访截止时间至2023年2月1日。随访的终点为随访时间截止或患者死亡。

1.4 统计学分析 采用SPSS25.0 统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，三组间比较采用F检验,两两比较采用LSD-t检验。采用受试者工作特征曲线（receiver operating curve，ROC）分析血清LG2m，hPG80 对HCC 患者生存预后的评估价值。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，Log-Rank 检验比较曲线间差异。采用单因素和多因素COX 回归分析HCC 患者预后的影响因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清LG2m，hPG80 水平比较 见表1。HCC 组血清LG2m，hPG80 水平较良性病变组和对照组显著升高，差异具有统计学意义(t=73.015，76.635；68.240，70.468，均P＜0.05)。

表1 各组血清LG2m，hPG80 水平比较（±s，ng/L）

表1 各组血清LG2m，hPG80 水平比较（±s，ng/L）

项 目HCC 组(n=128)良性病变组（n=70）对照组（n=70）FP LG2m28.14±3.109.18±1.748.24±1.652 070.7390.000 hPG8084.83±11.3925.10±4.1123.15±3.261 777.7840.000

2.2 血清LG2m，hPG80 水平与HCC 临床病理参数的关系 见表2。TNM 分期Ⅲ期、低分化程度、血清AFP＞400μg/L 患者血清LG2m，hPG80水平高于TNM 分期I～Ⅱ期、高中分化程度，AFP ≤400μg/L 患者，差异均具有统计学意义(均P＜0.05)。

表2 血清LG2m，hPG80 水平与HCC 临床病理参数的关系（±s，ng/L）

表2 血清LG2m，hPG80 水平与HCC 临床病理参数的关系（±s，ng/L）

类 别nLG2mtPhPG80tP年龄（岁）＜605427.76±3.04 0.1190.905 83.20±12.50 1.4050.162≥607428.42±3.5886.02±10.18性别男性7028.45±2.99 1.2460.215 85.06±10.24 0.2510.802女性5827.77±3.1784.55±12.74肿瘤直径(cm)≤55227.61±3.56 84.02±12.60 0.6450.520＞57628.50±3.0385.38±11.06 1.5190.131 TNM 分期I～Ⅱ6125.38±3.04 80.20±12.34 4.4650.000Ⅲ6730.65±3.2389.05±10.05 9.4810.000肿瘤分化程度高中分化7323.58±3.04 81.88±11.39 13.5520.000 3.2160.002低分化5531.19±3.2888.74±12.65血清AFP(μg/L)≤4005826.11±3.10 6.8120.000 80.03±12.57 4.3360.000＞4007029.82±3.0488.81±10.34 HBV 感染有7828.55±3.08 85.03±10.25 0.2600.795无5027.50±3.1584.52±11.68 1.8650.064脉管浸润有3928.44±3.24 85.51±12.20 0.4480.655无8928.01±3.0584.53±11.04 0.7200.473

2.3 血清LG2m，hPG80 对HCC 的预后评估价值见表3，图1。以HCC 患者随访中是否死亡为因变量（是=1，0=否），ROC 曲线分析结果，血清LG2m，hPG80 联合对HCC 患者预后评估的曲线下面积为0.934，大于单项指标检测的0.813 和0.896。

图1 时间依赖ROC 曲线分析血清LG2m，hPG80 对HCC 的预后评估价值

表3 血清LG2m，hPG80 对HCC 的预后评估价值

2.4 不同血清LG2m，hPG80 水平HCC 患者生存预后比较 HCC 患者随访中，2 例失访，63 例死亡，五年总体生存率为50.78%（65/128）。以表3 中血清LG2m，hPG80 诊断HCC 预后的最佳截断值为临界值，将HCC 患者分为LG2m 高表达组（＞29.69ng/L，n=65）和低表达组（≤29.69ng/L，n=63），hPG80 高表达组（＞85.81ng/L，n=62）和低表达组（≤85.81ng/L，n=66）。

血清LG2m 高表达组和低表达组HCC 患者的五年总体生存率分别为33.33%（21/63），67.69%（44/65）。与血清LG2m 低表达HCC 患者相比，血清LG2m 高表达HCC 患者五年累积生存率更低(Log-Rankχ2=19.522，P=0.000)。血清hPG80 高表达和低表达组HCC 患者的五年总体生存率分别为35.48%（22/62），65.15%（43/66）。 与血清hPG80 低表达HCC 患者相比，血清hPG80 高表达HCC患者五年累积生存率更低(Log-Rankχ2=12.546，P=0.000)。见图2。

图2 Kaplan-Meier 生存分析血清LG2m，hPG80 水平对HCC 患者预后影响

2.5 血清LG2m，hPG80 水平与HCC 预后关系的单因素、多因素分析 见表4，5。结果显示TNM分期Ⅲ期、低分化程度、血清AFP ≥400μg/L 和LG2m 高表达，hPG80 高表达是HCC 患者不良生存预后的独立危险因素。

表4 HCC 患者预后的单因素COX 回归分析

表5 HCC 患者预后的多因素COX 回归分析

3 讨论

我国肝癌发病率约14.80/10 万，死亡率约9.51/10 万，严重威胁人民健康[7]。HCC 的治疗方案包括手术治疗、介入治疗、化疗等，但HCC 肿瘤恶性程度高，肿瘤容易复发转移，患者生存预后较差[8]。目前临床上主要根据TNM 分期系统、巴塞罗那临床分期系统对HCC 患者的预后进行评估。但由于HCC 肿瘤的异质性和复杂性等因素，各预后评估系统尚不能准确评估所有患者的临床预后。深入研究HCC 的疾病机制，寻找能够有效评估HCC 患者临床预后的生物标志物，具有重要的临床意义。

层黏连蛋白γ2 单体(LG2m)是层黏连蛋白的构成成分，其作为基底膜中细胞外基质蛋白，在细胞黏附、迁移等过程中发挥重要的调控作用。研究发现，多聚体形式的层黏连蛋白可水解为单体形式的LG2m，在胃癌等恶性肿瘤中发挥促进肿瘤细胞迁移和侵袭作用[9]。本研究中，HCC 患者血清LG2m 升高，这与既往在HCC 组织中通过免疫组织化学方法检测的结果一致[9]。HCC 患者血清LG2m 升高与基质金属蛋白酶对层黏连蛋白蛋白酶解有关。研究表明，HCC 中基质金属蛋白酶-14 表达升高[10]，基质金属蛋白酶-14 能够裂解层黏连蛋白的LG2m 链的结构域，导致血清游离LG2m 水平升高[11]。本研究中,血清LG2m 与HCC 患者不良临床病理特征有关，提示LG2m 参与HCC 的肿瘤进展。研究表明，LG2m 含有层黏连蛋白-表皮生长因子样基序样结构域，通过结合表皮生长因子受体，激活下游AKT 信号传导，促进肿瘤细胞恶性增殖、侵袭转移，导致肿瘤进展[12]。尚有学者在卵巢癌中发现，分泌的LG2m 能够与核受体亚家族6A 组成员1 形成融合蛋白，激活表皮生长因子信号通路，促进卵巢癌肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[4]。本研究中，血清LG2m 对HCC 患者的生存预后具有较高的诊断价值，LG2m 高表达的HCC患者生存预后更差，表明血清LG2m 是评估HCC患者生存预后的血清标志物。分析其机制，一方面是LG2m 能够促进HCC 的肿瘤恶性进展，导致患者不良预后。研究表明，HCC 肿瘤细胞中LG2m的表达升高能够结合肿瘤细胞表面跨膜整合素受体α3β1，激活转录因子Snail 的表达，促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，肿瘤细胞的侵袭和迁移能力增强，容易形成微小转移病灶及脉管内癌栓，术中难以彻底切除，导致术后肿瘤复发和转移[13]。另一方面是LG2m 的表达上调能够降低肿瘤对化疗等治疗的敏感性，导致不良生存预后。有学者报道能够上调胰腺癌中三磷酸腺苷结合盒转运蛋白表达，促进吉西他滨等化疗药的外排，增强肿瘤细胞对铂类化疗药物的耐药性[14]。因此，HCC 中LG2m 的表达升高促进肿瘤的发生发展，是新的HCC 预后相关肿瘤标志物。

人循环前胃泌素（hPG80）是由GAST 基因编码的80 个氨基酸的蛋白。胃窦G 细胞中hPG80 翻译后在内质网中折叠，由高尔基体包装、切割加工形成成熟的胃泌素，并以囊泡形式转运分泌到细胞外[15]。近年来发现，乳腺癌等恶性肿瘤患者血清hPG80 水平升高，并增加肿瘤复发和转移的风险，是新的肿瘤诊断及预后评估的血清标志物[16]。本研究中，HCC 患者血清hPG80 水平升高，这与DUPUY 等[17]学者在早期HCC 中发现的血清hPG80 水平升高的研究结果一致。HCC 患者血清hPG80 水平升高与肿瘤中Wnt 通路的过度激活有关。研究表明，HCC 中存在WNT/β-连环蛋白/T细胞因子4 激活的现象，T 细胞因子4 活化后进入细胞核，结合hPG80 的编码基因GAST 的启动子区域，在转录水平激活hPG80 的表达，引起HCC 患者血清hPG80 水平升高[18-19]。本研究中，hPG80 与HCC 患者不良临床病理特征有关，提示hPG80 促进HCC 的肿瘤进展。分析其机制，hPG80 能够通过上调肿瘤干细胞标志物如性别决定区Y 框蛋白4的表达，增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力，导致肿瘤恶性进展[20]。有学者利用hPG80 单克隆抗体对结直肠癌、食管癌及肝癌等肿瘤细胞系进行体外孵育，发现其能够明显抑制肿瘤细胞的增殖及干细胞样特征，减弱肿瘤细胞的侵袭和转移能力[21]。因此，HCC 中hPG80 的表达升高促进肿瘤发生发展，是潜在的HCC 预后及治疗靶点。本研究发现，血清hPG80 对评价HCC 患者的生存预后具有较高的诊断价值，提示hPG80 是新的评估HCC 预后相关血清标志物。研究发现，肿瘤细胞分泌的hPG80 可作用于肿瘤微环境中的成纤维细胞，促进其向肿瘤相关成纤维细胞分化，抑制肿瘤微环境中肿瘤杀伤性CD8+T 淋巴细胞的浸润，导致肿瘤免疫逃逸的发生[21]。另外，hPG80 的升高亦能够增加HCC 肿瘤复发及转移的风险，导致患者不良预后。研究发现，肿瘤细胞中hPG80 的表达上调能够增强肿瘤干性标志物表达，促进肿瘤细胞对化疗药物耐药性形成，降低化疗治疗有效性，导致患者不良预后[6]。

本研究中，TNM 分期Ⅲ期、低分化程度和血清AFP ≥400μg/L 是HCC 患者不良生存预后的独立危险因素，这与既往研究报道一致[22]。笔者分析，对于高TNM 分期、低分化程度及血清AFP 水平较高的HCC 患者，肿瘤恶性程度高，易发生血管侵犯及病灶周围微小转移灶，术中肿瘤切除难度大，这些因素均会增加患者治疗后肿瘤复发和转移率，影响HCC 患者远期生存预后。

综上所述,HCC 患者血清LG2m 和hPG80 水平升高，两者表达与TNM 分期、肿瘤分化程度、AFP 水平有关，均参与HCC 的肿瘤发生发展过程。血清LG2m，hPG8 高表达的HCC 患者临床预后较差，是HCC 患者不良生存预后的独立危险因素，两项联合能有效评估HCC 患者生存预后。因此，血清LG2m 和hPG8 可作为新的评价HCC 患者临床预后的生物标志物，同时结合传统的肿瘤TNM分期及肿瘤分化程度等临床病理因素，综合评估HCC 患者的生存预后。但本研究也存在一定的局限，本研究样本量有限，未能动态监测血清LG2m和hPG8 水平变化，有待今后设计多中心大样本临床实验，进一步研究HCC 患者血清LG2m 和hPG8水平变化的临床意义。