重度子痫前期患者胎盘组织中CD44 mRNA和CD24 mRNA及蛋白表达水平的临床价值研究

滕玲玲，马广贞，石 可，吕颖欣，徐 静（1.聊城市第二人民医院 a.产科；b.病理科，山东临清5601；.河北医科大学第一医院产科，石家庄 050000）

子痫前期（preeclampsia，PE）是最危险的妊娠高血压疾病之一，在妊娠20 周后发展，发生在2%～8%的妊娠中[1]。重度子痫前期（severe preeclampsia，SPE）是PE 较为严重的类型，发生率约为14.20%，严重威胁孕妇和围产儿的健康[2-3]。由于目前对SPE 的发病机制尚不明确，在临床中SPE 的防治是个巨大挑战[1]。因此探寻与SPE 有关的生物标志物为SPE的临床诊疗提供新的研究方向。研究表明，PE 是全身性血管疾病[4]。细胞表面跨膜糖蛋白分子（cell surface transmembrane glycoprotein molecules，CD）44 是一种跨膜80～90 kDa 细胞表面黏附分子糖蛋白，与细胞外结构域配体的相互作用对细胞信号传导调节至关重要，包括血管生成、细胞迁移和侵袭等过程[5]。CD24 是一种细胞黏附分子，与各种实体瘤的转移性肿瘤进展有关，研究发现CD44，CD24 低表达与三阴性乳腺癌患者的预后不良密切相关[6]。目前，CD44，CD24 在SPE 中的研究鲜有报道。因此，本研究通过检测SPE 患者胎盘组织中CD44 mRNA，CD24 mRNA 及蛋白表达水平，探讨二者对SPE 的临床诊疗价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年6月～2022年6月在聊城市第二人民医院接受剖宫产分娩的SPE 患者，根据发病孕龄的不同，进一步将其分为早发型SPE组（孕龄≤34 周，n=45）和晚发型SPE 组（孕龄＞34 周，n=55）。纳入标准：①符合《妇产科学》[7]中SPE 的诊断标准；②活胎单妊娠；③自然受孕。排除标准：①并发传染、免疫、血液性系统疾病者；②并发恶性肿瘤者；③并发心、肝、肾等功能障碍者；④并发生殖器官畸形及其他妊娠并发症者。选取同期产检正常者100 例为对照组。SPE 组年龄为23～49 岁，BMI 为20～36 kg/m2，分娩孕周为32～40 周。对照组年龄为23～48 岁，BMI 为19～34 kg/m2，分娩孕周为31～39 周。两组间年龄无显著性差异（t=0.314，P＞0.05），具有可比性。两组间BMI 和分娩孕周差异具有统计学意义（t=5.360，3.232，均P＜0.05）。本研究通过本院伦理委员会批准，并得到所有参与者的知情同意。

1.2 仪器与试剂 TRIzol 试剂、PCR 试剂盒（德国Qiagen 公司）；逆转录试剂盒（日本TaKaRa 公司）；荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；480II RT-PCR 系统（Roche，Basel，Switzerland）。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测CD44 mRNA，CD24 mRNA 的表达水平：研究者在剖宫产后立即避开钙化及出血部位，从胎盘表面不同位置处取多块约1cm × 1cm × 1cm 的组织，用冷PBS 洗净血液后放-80℃待测。使用TRIzol 试剂从处于冻存状态的组织中提取总RNA，进一步反向转录。计算A260nm/A280nm比率以评估RNA 质量和纯度。在推荐的热循环设置下，使用480II RTPCR 系统进行qRT-PCR 分析，步骤如下：95℃进行一次初始循环（30s），然后95℃循环55 次（每次15s），60℃循环20s，72℃循环15s。以GAPDH为内参。基因相关序列见表1。反应结束后CD44 mRNA，CD24 mRNA 的相对表达量采用2-ΔΔCt方法计算。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.2 免疫组织化学检测CD44，CD24 蛋白表达：采用免疫组织化学试剂盒（DAKO Corporation，USA）检测CD44 和CD24。参照文献[6]对染色进行评估。CD44 mRNA，CD24 mRNA 蛋白表达水平基于阳性细胞百分比和细胞染色强度的总组合进行评分：200 倍镜下选取5 个视野，以棕黄色或棕色颗粒为阳性标准，阳性细胞的百分比评分为0（无阳性细胞），1分（≤5%阳性细胞），2分（＞5%～25%细胞染色阳性），3 分（＞25%～50%细胞染色阳性），4分（＞50%细胞染色阳性）；染色强度评分为1分（淡黄色），2 分（黄棕色）和3 分（棕褐色）。计算每个组织样本的总分，＞3 分为阳性、≤3 分为阴性。

1.3.3 临床资料收集：①一般资料：如年龄、体质量指数、孕周、是否初产、舒张压、收缩压；②实验室指标：如血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、24h 蛋白尿、总胆红素（TBIL）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、清蛋白（ALB）、肌酐（Cr）、乳酸脱氢酶（LDH）、尿素氮（BUN）；新生儿性别、出生时身长、体质量等。

1.4 统计学分析 选用SPSS25.0 软件对数据进行统计学分析。计数资料以n（%）表示，组间比较用χ2检验；符合正态分布计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；采用Pearson 法分析SPE 患者组织中CD44，CD24 表达及与临床特征的相关性；采用多因素Logistic 回归分析的SPE 影响因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD44，CD24 在SPE 组与对照组胎盘组织中mRNA 及蛋白的表达 见表2。经t检验分析，相较于对照组，SPE 组胎盘组织中CD44 mRNA，CD24 mRNA 的表达水平均降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。免疫组织化学染色结果显示，CD44，CD24 在SPE 组胎盘组织中多呈阴性表达或弱阳性表达，而在对照组中多呈阳性表达，且经方差分析，SPE 胎盘组织中CD44，CD24 阳性率均低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 CD44，CD24 在SPE 组与对照组胎盘组织中mRNA 及蛋白的表达情况[±s，n（%）]

表2 CD44，CD24 在SPE 组与对照组胎盘组织中mRNA 及蛋白的表达情况[±s，n（%）]

项目对照组（n=100）SPE 组（n=100）χ2/tP CD44 mRNA1.02±0.330.55±0.1213.3850.001 CD24 mRNA1.05±0.110.68±0.1916.8530.001 CD44 阳性率63（63.00）41（41.00）9.6960.002 CD24 阳性率75（75.00）49（49.00）14.3460.001

2.2 不同孕龄SPE 组患者胎盘组织中CD44 mRNA，CD24 mRNA 表达水平比较 经t检验分析，相较于早发型SPE 组，晚发型SPE 组胎盘组织中CD44 mRNA（0.65±0.17 vs 0.42±0.11），CD24 mRNA（0.77±0.23 vs 0.58±0.13）的表达水平均上升，差异具有统计学意义（t=7.830，4.932，P＜0.05）。

2.3 SPE 组与对照组临床特征的比较 见表3。经t检验分析和方差分析，相较于对照组，SPE组BMI，收缩压、舒张压、尿蛋白、Cr，LDH 和BUN 均升高，差异具有统计学意义（均P＜0.05）；SPE 组分娩孕周较早、MPV，ALB 较低、新生儿出生身长较短、体质量较轻低于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。而两组的年龄、是否初产、PLT，TBIL，AST，ALT、新生儿性别等差异无显著性差异。

表3 SPE 组与对照组临床特征的比较

2.4 胎盘组织CD44 mRNA，CD24 mRNA 水平与SPE 患者临床特征的相关性分析 见表4。经Pearson 分析，SPE 胎盘组织中CD44 mRNA 的表达分别与分娩孕周、MPV，新生儿出生身长呈正相关（r=0.639，0.612，0.465，均P＜0.05）；与收缩压、尿蛋白、LDH 呈负相关（r=-0.604，-0.569，-0.593，均P＜0.05）。CD24 mRNA 的表达分别与分娩孕周、MPV，新生儿出生身长呈正相关（r=0.605，0.584，0.640，均P＜0.05）；与收缩压、尿蛋白、LDH 呈负相关（r=-0.637，-0.593，-0.561，均P＜0.05）。

表4 胎盘组织CD44 mRNA，CD24 mRNA 水平与SPE 患者临床特征的相关性分析

2.5 SPE 影响因素的多因素Logistic 回归分析 以是否发生SPE（否=0，是=1）为因变量，以表2，表4 中P＜0.05 的因素BMI，分娩孕周、舒张压、收缩压、MPV，尿蛋白，ALB，Cr，LDH，BUN、新生儿出生身长、新生儿体质量、CD44 和CD24 水平（具体值）为自变量，进行Logistic 回归分析。结果显示，MPV（95%CI：1.429～4.350），尿蛋白（95%CI：1.529～2.709），LDH（95%CI：1.425～3.932）均是发生SPE 的独立危险因素（P＜0.05）。高水平CD44（95%CI：0.561～0.940），CD24（95%CI：0.495～0.814）是发生SPE 的独立保护因素（P＜0.05），见表5。

表5 影响SPE 发生的多因素Logistic 回归分析

3 讨论

妊娠是受精卵经过输送、分裂、胚胎发育后着床的一系列过程，任一环节出现问题均会出现妊娠期并发症及不良分娩结局[8]。子痫前期（PE）是妊娠期出现的常见并发症，重度子痫前期（SPE）是PE 疾病的严重情况[9]。其主要表现为全身小动脉痉挛，由于周身阻力形成微血栓，进一步出现肝、肾、脑、胎盘等器官血流灌注不足而出现机体功能受损以及胎儿生长受限的情况，是导致母婴死亡的主要因素[9-10]。目前SPE 的发病机制尚不明确。使用生物标志物监测病情已成为热点，现已有一些生物标志物对PE 或SPE 进行研究，如血清亲环素A，组织型转谷氨酰胺酶、内皮细胞特异性分子等，但均未推广使用[11-12]。因此，探寻能准确反映SPE 的新的生物标志物，对SPE 疾病的临床治疗提供新的研究方向十分重要。

先兆子痫是妊娠期的主要心血管并发症，炎症反应的级联反应可通过炎症细胞浸润血管组织并释放蛋白酶、细胞因子和活性氧来改变组织中的血流，从而引发血管收缩或松弛[13-14]。细胞表面跨膜糖蛋白分子（CD44）是一种广泛表达的细胞黏附分子，是细胞外基质（ECM）成分的主要受体，在炎症和血管损伤中均起重要作用，据报道，FK506 结合蛋白样蛋白(FKBPL)-CD44 通路似乎在PE 的发病机制中起核心作用，有望对其进行早期诊断和治疗[13]。

CD24 在脂肪细胞前体细胞中显示高表达水平，在许多类型的人类癌症中的高表达表明癌症、糖尿病和肥胖之间存在关联，研究发现CD24 KO雄性小鼠在早期表现出更高的胰岛素敏感性和葡萄糖摄取[15]。SAMMAR 等[16]人发现，CD24 在PE 的患者中表达降低，与PE 的免疫耐受性降低有关。本实验发现SPE 患者胎盘中CD44 mRNA 和CD24 mRNA 表达降低，且SPE 胎盘组织中CD44和CD24 阳性率低于对照组；高水平CD44 mRNA和CD24 mRNA 是SPE 发生的独立保护因素，与上述研究结果一致，提示高水平CD44 和CD24 对SPE 疾病有抑制作用。本研究进一步表明，CD44 mRNA 与CD24 mRNA 表达呈正相关（r=0.611，P＜0.05），提示二者相互作用，共同在SPE 中发挥作用。此外，SPE 的发病孕期越早，病情越严重[17]。本研究中早发型SPE 患者胎盘中CD44 mRNA 和CD24 mRNA 的水平低于晚发型SPE，提示CD44 和CD24 水平与SPE 的严重程度有关，与ONYANGUNGA 等[18]实验结果一致。MPV 检测全身炎症反应，是PE 重要的生物标志物[19]。

本实验发现MPV 表达下降，提示SPE 患者机体处于炎症状态。与上述报道相对应[13-14]。此外，CD44 mRNA，CD24 mRNA 与MPV 呈现正相关，表明二者均可通过与炎症因子相互作用加重SPE。蛋白尿水平可通过血管内皮细胞损伤增加血管通透性，是影响PE 进展的因素之一[20]。本实验中SPE患者蛋白尿水平较高，与ŞALK 等[20]人实验结果一致。CD44，CD24 与蛋白尿呈现负相关，表明SPE 患者中低水平CD44，CD24 加重血管内皮损伤，累积蛋白尿。PE 患者胎盘缺氧，会增加厌氧糖酵解的代谢途径，LDH 在厌氧糖酵解可催化丙酮酸转化为乳酸，加重PE，因此在PE 患者中LDH 数量增加。本实验SPE 患者中LDH 表达上升，是SPE发生的独立危险因素，进一步验证了上述言论。这可能与SPE 患者中血管内皮细胞障碍，溶血后可使血浆中LDH 水平升高有关[21]。因此猜测本实验可能是低水平CD44 和CD24 相互作用，加重SPE，进一步导致患者机体炎症聚集，血管内皮细胞障碍。然而本实验仅研究了SPE 患者胎盘CD44 和CD24水平与SPE 的一般资料及实验室指标的的相关性，其具体机制还需进一步研究。

综上所述，随着SPE 疾病的加深，胎盘中CD44 mRNA 和CD24 mRNA 表达水平均降低，高水平CD44 mRNA 和CD24 mRNA 是SPE 发生的独立保护因素，MPV，尿蛋白、LDH 是SPE 发生的独立危险因素，参与SPE 疾病的发生。但本实验中样本量较小，实验结果具有一定局限性。后续可用大样本对SPE 的具体机制进行研究，对临床中SPE的诊疗提供基础依据。