纳米材料尺寸依赖的细胞自噬效应的机制研究

阮 晨, 贾永鹏, 吴 冉, 王来友, 黄可心, 李玉珠

(1.南阳理工学院河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室 河南 南阳 473004;2.南阳理工学院生物与化学工程学院 河南 南阳 473004;3.南阳理工学院信息工程学院 河南 南阳 473004;4.南阳师范学院化学与制药工程学院 河南 南阳 473061)

0 引言

细胞自噬是一种重要的生物学过程,它在动植物及真菌等生物中保持了高度的保守性[1]。这一过程使细胞可以有效应对周围的应激环境,平衡和保证细胞内的能量流动,保证细胞的内部稳态[2]。除此之外,它还可以去除细胞内受损的细胞器,清理并分解细胞内出现的错误冗余蛋白质,消灭入侵细胞的异常物质,它在癌症和自身免疫性疾病的治疗方面发挥了重要的作用[3]。

纳米材料是空间尺度在100 nm以内的一种微型材料的通称。研究人员发现,金属纳米颗粒、量子点、稀土元素氧化物纳米颗粒和树状大分子等均可以引发细胞的自噬现象[4]。到目前为止,纳米颗粒引发的细胞自噬紊乱现象被认为是纳米材料的主要生物毒性之一,而相关研究大部分集中在具有自噬诱导效应的新型材料的发现,其具体诱导调控机制的研究仍处于浅层阶段,有待深入挖掘[1,5]。

本项目以二氧化硅纳米颗粒(Silica nanoparticles, SiNPs)诱导Hela细胞的自噬效应为研究对象,探讨不同尺寸的二氧化硅纳米颗粒对细胞的自噬效应。并以此为基础结合转录组测序技术(RNA Sequencing, RNA-seq)系统鉴定二氧化硅纳米颗粒处理细胞后的转录组,经计算分析后筛选差异基因,设计RNA干扰实验进行功能验证,揭示二氧化硅纳米颗粒诱导细胞自噬激活过程中参与调控的功能蛋白分子,为纳米材料在生物医学上的应用与优化提供了有价值的参考信息。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

DEME高糖培养基、胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司。磷酸盐缓冲液、青霉素、链霉素、蛋白检测试剂盒,杰特生物科技有限公司。Anti-LC3抗体、Anti-ACTB抗体、Anti-GFP抗体,武汉三鹰生物科技有限公司。PVDF膜、蛋白酶抑制剂、甘氨酸等试剂,麦克林生化科技有限公司。

细胞培养箱、液氮罐,新乡新亚低温有限公司。蛋白质免疫印迹仪器套装,武汉联丰盛生物科技有限公司。全波长酶标仪,杭州米欧仪器有限公司。双色红外成像系统,美国Odyssey公司。

1.2 纳米颗粒的制备

首先将9.1 mg L-精氨酸充分溶解于6.9 mL纯水中,然后将0.45 mL环己烷加入精氨酸水溶液中充分混匀。混匀装置采用磁搅拌装置,同时水浴加热反应至60 ℃。其次,向反应溶液中加入0.55 mL原硅酸四乙酯,恒温搅拌20 h,由此得到最小的二氧化硅纳米颗粒种子。接着采用再生法制备其他尺寸较大的二氧化硅纳米颗粒,得到所需要的二氧化硅纳米颗粒后,对其表面进行羧基修饰。

1.3 细胞培养传代与自噬水平的评价

从液氮罐中取出冻存细胞复苏后离心,加入新鲜培养基后放入恒温细胞培养箱开始培养,培养温度为37 ℃,CO2浓度为5%。培养细胞汇合度至70%时,进行细胞传代。传代后继续培养,培养至细胞汇合度至80%时,用不同尺度的60 μg/mL二氧化硅纳米颗粒处理细胞24 h。处理完毕后,用胰酶消化洗脱细胞,用低盐裂解液裂解细胞样本提取总蛋白,使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白定量。取适量蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳, 电泳完毕后用湿转法把目标蛋白转移至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉封闭过夜。封闭完毕清洗,分别用含有一抗的PBS溶液封闭过夜,封闭温度为4 ℃。第二天用含有二抗的PBS溶液室温孵育2 h,再次洗涤后置于凝胶成像系统成像[6]。

1.4 总RNA提取与转录组测序

用二氧化硅纳米颗粒处理细胞后,每个时间点约取3×106个细胞,迅速置于液氮中冻存备用。取样完毕后,每个细胞样品分别加入Trizol充分混匀离心取上清,获取RNA沉淀。DECP水溶解分装后,置于超低温冰箱保存。使用Nanodrop 2000 spectrophotometer检测RNA样品纯度。Qubit 3.0检测RNA样品浓度。使用Labchip GX检测样品RNA的ROS(RNA quality score)值。建库完成将样品送至武汉百迈克生物科技有限公司进行测序,得到经过质控过滤后的高质量测序数据(Clean data)。

1.5 组学数据注释及分析

使用Tophat程序用bowtie2将数据中的reads回帖至大鼠(rat)参考基因组根据经典剪切位点标记寻找可能剪切组合[7]。Tophat进一步在没有剪切位点注释信息下建立比对索引[7]。使用Cufflinks程序拼接前一步中获得的转录本,并计算表达量。使用Cuffmerge程序将获得的转录本数据整合成一个数据集,使所有转录本数据都基于一个标准进行展示和计算[8]。最后用Cuffdiff程序滤筛选差异表达基因[9]。GO(Gene Ontology)富集分析均采用R语言进行计算[8,10-12]。

1.6 RNA干扰实验

培养细胞至细胞汇合度在80%时,用RNA转染试剂转染每个基因相应的siRNA 48 h。用PBS溶液清洗3次后,用二氧化硅纳米颗粒处理细胞。收集细胞样品,用免疫印迹实验检测LC3B-II蛋白的表达量。

1.7 数据分析与绘图

使用Microsoft office excel 2016、R language进行数据分析和计算。用R language进行绘图。

2 结果与分析

2.1 构建GFP-LC3-Hela细胞系

培养细胞至细胞汇合度在70%时,洗涤后加入与GFP-LC3腺病毒转染原液充分混合后的新鲜培养基,腺病毒侵染48 h。在荧光共聚焦显微镜下观察,根据荧光光斑数量选取侵染效率高的细胞,用于后续荧光拍照实验(见图1)。

图1 GFP-LC3-Hela细胞系荧光拍照图

2.2 不同规格的纳米材料对细胞自噬效应影响

培养细胞至细胞汇合度在70%～80%时,用不同尺度的二氧化硅纳米颗粒(60 μg/mL)分别处理细胞24 h。收集细胞样品,用免疫印迹实验检测细胞自噬Marker LC3-II蛋白的表达情况(如图2)。由实验结果可知,经16 nm二氧化硅纳米颗粒处理细胞后,细胞内LC3-II蛋白质表达量为最大,细胞自噬活性最强。纳米材料尺寸越大,LC3-II蛋白质表达量越小,自噬活性越小。紧接着,用GFP-LC3-Hela细胞系进行荧光拍照实验,将16 nm的二氧化硅纳米颗粒处理细胞24 h后,进行荧光拍照,拍照

图2 不同尺度不同规格的纳米材料对细胞自噬效应影响

结果如图3。自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过斑点数量来评价自噬活性的高低[2,13-14]。由拍照结果可知,细胞内生成了大量的自噬体,细胞自噬被激活。

图3 纳米材料处理后细胞内GFP-LC3荧光斑点成像拍照

2.3 转录组测序及分析

用16 nm二氧化硅纳米颗粒处理细胞24 h后,送样进行转录组测序。总mRNA提取后进行质量检测,如表1所示。待建库样本总mRNA浓度均在500 ng/μL以上。样本OD260/280的值均在标准区间内,总mRNA纯度较高。反映RNA完整性的质量评估参数RQS值均在9以上,满足建库要求。

表1 总mRNA质量检测

测序完毕拿到Clean data后,用Tophat-Bowtie2-Cufflink程序在Linux系统上进行分析。Cuffdiff程序设定阈值计算过滤筛选差异表达基因。差异表达基因的过滤条件为|log2(Fold Change)|>1和p<0.05。根据筛选阈值共过滤出422个差异基因,其中共有231个上调基因和191个下调基因。

为了更加清晰地了解差异基因可能发挥的生物学功能以及参与的信号通路,对上一步过滤出的差异表达基因进行GO富集分析。分析结果如图4所示,差异基因主要富集在mTOR信号通路、MAPK信号通路、cAMP信号通路及动物自噬信号通路等,这些信号通路与细胞自噬的发生存在紧密联系[1,15]。这从一个侧面说明过滤出的差异表达基因可能在其中发挥调控功能。同时选取差异基因排序靠前的18个基因进行后续实验验证,各基因的表达热图如图5所示。

图4 GO富集分析

2.4 差异表达基因的相关功能验证

对2.6中选取的差异基因进行筛选和功能验证,采用表达干扰和免疫印迹实验进行验证。各基因设计siRNA后转染细胞,转染48 h。洗涤后,用二氧化硅纳米颗粒处理细胞24 h。提取细胞蛋白利用免疫印迹实验检测自噬蛋白Marker LC3B-II的表达量[1]。由图6可知,干扰Casp4基因的表达,可以降低细胞内LC3B-II蛋白的表达量,影响细胞自噬的正常进行,细胞的自噬活性降低。

3 讨论与结论

在当代,纳米材料的研发越来越快,并走进人们生活,应用于食品、医疗、化工、通信等各种领域。不可避免的接触和使用带来了纳米材料在人体内部的积累和转移,其潜在的危害引起科学家们的重视,相关研究持续展开。在纳米毒理和细胞自噬的领域,大多数研究集中在对具有引起细胞自噬效应的纳米材料的发现和探讨,其具体机制研究仍处于浅层阶段,相关组学数据的产出也寥寥可数。

在本研究里,为了探究和寻找纳米材料诱导细胞自噬的相关调控基因及机制,以二氧化硅纳米颗粒诱导细胞自噬效应为核心,首先探究了不同尺寸的二氧化硅纳米颗粒对细胞的自噬效应,研究发现不同尺度的二氧化硅纳米颗粒诱导细胞自噬的效应不同,尺寸越小的纳米颗粒自噬效应越明显。在相关的研究中,已有科学家发现纳米和亚微米尺寸的二氧化硅纳米颗粒通过小窝蛋白介导的内吞作用和巨饮进入细胞引发细胞中的自噬作用[16]。在本研究里,我们发现16 nm的二氧化硅纳米颗粒的诱导细胞自噬效应最强。以此为条件进行转录组测序和分析,研究共发现422个差异表达基因,差异基因的GO富集分析结果显示这些基因主要参与的信号通路与自噬发生过程有若干联系。其中,mTOR(Mammalian target of rapamycin)的一种特定复合物mTORC1蛋白是自噬的关键分子,mTORC1通过磷酸化形成的自噬调节复合物直接或间接参与自噬的各个过程中[17]。MAPK (mitogen-activated protein kinases)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它通过磷酸化和去磷酸化影响细胞内自噬体以及自噬的发生过程[18]。这个结论表明过滤出来的差异基因可能在自噬的相关信号通路中发生作用。紧接着,论文选取排序靠前的差异表达基因进行RNA干扰实验功能验证。LC3-II是哺乳动物细胞自噬研究的标志蛋白[19]。当细胞自噬活动被激活,LC3-I蛋白被相关功能酶剪切,从而形成LC3-II。由于两种蛋白分子的分子质量不同,因此可以通过免疫印迹实验中的电泳进行分离,检测LC3-II蛋白的显影灰度值就可以对细胞的自噬水平进行评价[20]。免疫印迹结果表明干扰基因Casp4的表达,可以降低细胞内LC3B-II的水平。综上,Casp4在二氧化硅纳米颗粒诱导细胞自噬的过程中发挥了一定功能,其具体机制仍需深入探究。

本研究围绕二氧化硅纳米颗粒诱导细胞自噬进行探究和实验,发现了新的潜在功能调控基因Casp4,希望这些发现可为细胞自噬相关机制的深入挖掘提供参考。