梅花鹿角盘胶原蛋白的鉴定及其理化性质

黄诗萌，王景琦，皮钰珍, ，邵俊花,

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110866；2.沈阳奉鹿堂生物科技有限公司，辽宁沈阳 110180）

梅花鹿角盘是雄性梅花鹿或马鹿经锯茸后，于次年脱落的，介于鹿茸骨化和未骨化之间十分坚硬的盘状骨化残角[1]。世界上养鹿业较发达的国家除中国外，只有新西兰、俄罗斯、韩国等少数几个国家，受饲养条件的限制，国内外从事鹿产品研究的并不多，对于梅花鹿角盘中主要药效成分之一胶原蛋白的研究报道甚少[2]。鹿角盘在民间药用较为广泛，具有温补肝肾、益精养血等功效，常用于腰膝酸冷、崩漏下血、阴疽肿痛等的治疗[3-4]。目前市场上的梅花鹿角盘，简单打粉，销售初级原料，没有充分开发其药用价值[5-7]。

通过利用酸溶液中的离子破坏蛋白分子内部的次级作用力和醛胺交联键，引起纤维膨胀、溶解，从而水解得到产物，即酸溶性胶原蛋白。作为溶剂使用的酸主要有乙酸、柠檬酸、甲酸和盐酸等，盐酸溶液浓度一般为0.01 mol/L，有机酸在0.1～0.5 mol/L 之间[8]。酸法提取能最大程度地保持胶原蛋白的三螺旋结构，但产品得率低。通过酶作用不同类型的肽键，利用其催化专一性将胶原进行限制性酶解，从而水解得到产物，即酶溶性胶原蛋白。蛋白酶会将分子末端肽Lys 相互作用形成的共价交联键切割下来，主体部分（三螺旋结构）即可溶于溶液中，进而再被提取出来，这样溶解的胶原仍有完整的螺旋区段。本研究比较了酸法和酶法提取的梅花鹿角盘胶原蛋白的结构及理化性质，为梅花鹿角盘中胶原蛋白的开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

梅花鹿角盘粉 由辽宁西丰养鹿场提供；胃蛋白酶（酶活力≥3000 U/mg）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）（AR 分析纯）、甲叉双丙烯酰胺（AR 分析纯）、考马斯亮蓝G-250 美国Sigma 公司；十二烷基硫酸钠（SDS）（AR 分析纯）臻鼎生物有限公司；（Bis）蛋白质标准分子量（BR 生化试剂）德国巴斯夫公司；丙烯酰胺（Acr）（AR 分析纯）天津市科密欧化学试剂有限公司；四甲基乙二胺（TMEDA）（AR 分析纯）国药集团化学试剂有限公司；过硫酸铵（APS）（AR 分析纯）美国Amresco 公司。

L-8800 氨基酸自动分析仪 日本日立公司；DYY-6C 稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂；ZHWY-2102 恒温振荡摇床 国华电器有限公司；Nicolet 6700 傅立叶红外光谱仪 Thermo Fisher Scientific 公司；UV-2100 型紫外可见分光光度计（尤尼柯）上海仪器有限公司；CT14RD 型冷冻离心机上海天美科学仪器有限公司；CR21G 高速离心机东京日立公司；210 mm 玻璃干燥器 郑州中天实验仪器有限公司；JY2001 型电子天平 上海方瑞仪器有限公司；pH S-25 型酸度计 上海理达仪器厂；40270520 型移液枪 美国热电公司。

1.2 实验方法

1.2.1 梅花鹿角盘ASC 的制备 梅花鹿角盘经超微粉碎后，浸于0.5 mol/L HCl 溶液中，料液比为1:10，振荡脱钙60 min，振荡频率200 r/min，然后用0.5 mol/L 的Na2CO3溶液浸泡，液面没过梅花鹿角盘粉，搅拌10 h 用纱布滤净，蒸馏水冲洗三遍，冷冻干燥成粉末；选用0.3 mol/L 乙酸在pH 为2.7，固液比为1:15 的条件下水解36 h 后过滤，向上清液中加入5 mL NaCl 进行盐析24 h，使溶液终浓度为3.0 mol/L，析出絮状白色沉淀于8000 r/min 离心30 min，沉淀部分用十倍体积的0.5 mol/L 乙酸溶解后，装入透析袋中，在0.1 mol/L 的乙酸中透析12 h，再在蒸馏水中透析48 h，将透析液冷冻干燥得到酸溶性胶原蛋白ASC[9-10]。

1.2.2 梅花鹿角盘PSC 的制备 将1.2.1 中乙酸水解后的沉淀选用胃蛋白酶（酶活力≥3000 U/mg）在加酶量为1.6%，固液比为1:20，温度为4 ℃条件下酶解2.5 h，将过滤后的上清液在95 ℃条件下进行灭酶5 min 并离心30 min，转速6000 r/min。上清液部分用10 倍体积的0.5 mol/L 乙酸溶解后，装入透析袋中，在0.1 mol/L 的乙酸中透析12 h，再在蒸馏水中透析48 h，将透析液冷冻干燥得到酶溶性胶原蛋白PSC[11-12]。

1.2.3 氨基酸分析 将1 g 的鹿角盘ASC 与PSC样品放入反应管，添加15 mL 5 mol/L HCl 溶液与3～4 滴苯酚溶液。真空封管，110 ℃条件下水解24 h。水解液加水至50 mL。量取2 mL 水解液，在50 ℃下干燥，再将其溶解于2 mL pH2.2 的磷酸缓冲试剂中。经过滤后，放入氨基酸自动分析仪进行测定[13]。

1.2.4 SDS-PAGE 凝胶电泳

1.2.4.1 电泳胶配方 SDS-PAGE 凝胶电泳采用5%的浓缩胶与7.5%的分离胶，用于非连续电泳系统[14]，具体配方如表1 所示。

表1 SDS-PAGE 凝胶电泳配方Table 1 Formula of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis

1.2.4.2 上样缓冲液配方 上样缓冲液配方采用2 倍还原缓冲液与2 倍非还原缓冲液，具体配方如表2 所示。

表2 还原和非还原上样缓冲液Table 2 Sample buffer of reduction and non-reduction

1.2.4.3 样品制备及电泳 将胶原蛋白样品ASC 和PSC 分别溶解于0.1 mol/L 的Tris-HCl（pH6.8）缓冲液中，至最终浓度为0.5 mg/mL，4 ℃下放置24 h，10000 r/min 离心3 min。将蛋白上清液与上样缓冲液l:1 等体积混合，60 ℃加热3 min，取10 μL 上清液点样。在槽中倒入含有1% SDS（w/v）的Tris-甘氨酸电泳液（pH8.3）。并于20 V 的浓缩胶和60 V的分离胶电压下进行电泳。

1.2.4.4 染色及脱色 在电泳完成后将凝胶取下。用0.05%的考马斯亮蓝染色l h。用脱色液在摇床内脱色2 h，并观察结果。

1.2.5 傅立叶变换红外光谱（FTIR）扫描 将冷冻干燥的鹿角盘ASC 和PSC 固体样品分别与干燥过的KBr 固体以2:100 的比例混合。然后研磨均匀，装样并压片。小心取出样品进行测定，设置傅立叶变换红外扫描仪分辨率为10 cm-1。在扫描区间为4000～400 cm-1区间对样品红外扫描[14]。

1.2.6 紫外扫描 将冷冻干燥的鹿角盘ASC 和PSC固体样品分别溶于0.3 mol/L 乙酸溶液中，配成2 mg/mL 的胶原蛋白溶液，置于1 cm 比色皿中，设置紫外-可见分光光度计在波长范围为200～400 nm内对其扫描，波长间隔为1 nm，测出最大吸收波长[15]。

1.2.7 梅花鹿角盘胶原蛋白的溶解度 用0.5 mol/L乙酸分别溶解梅花鹿角盘ASC 和PSC 冻干品，分别制成质量浓度为3 mg/mL 和6 mg/mL 的蛋白溶液，测定胶原蛋白的溶解度。胶原蛋白的溶解度采用蛋白质分散指数（PDI）表示[16]。

式中：m1为上清液蛋白质含量，g；m2为总蛋白质含量，g。

1.2.7.1 pH 对胶原蛋白溶解度的影响 取8 mL 配好的蛋白溶液（质量浓度为3 mg/mL）加入到50 mL离心管中，用磷酸缓冲液调节pH 分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 7 个水平后用蒸馏水定容至10 mL，在4 ℃条件下10000 r/min 离心20 min。测定胶原蛋白溶解度。

1.2.7.2 NaCl 浓度对胶原蛋白溶解度的影响 取5 mL 配好的蛋白溶液（质量浓度为6 mg/mL）加入到50 mL 离心管中，与5 mL 浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 mol/L 的NaCl 溶液混合，在4 ℃条件下10000 r/min 离心20 min。测定胶原蛋白溶解度。

1.2.8 梅花鹿角盘胶原蛋白的起泡性和起泡稳定性

取10 mg/mL 梅花鹿角盘ASC 和PSC 溶液100 mL于高速搅拌机中，10000 r/min 的速度搅打1 min，倒入量筒中读取泡沫体积；再将泡沫静置30 min 后，观察记录泡沫体积，以大豆分离蛋白作为对照。胶原蛋白起泡性（FE）和泡沫稳定性（FS）的计算公式如下[17]。

式中：V 为搅打后泡沫的体积，mL；V0为搅打前的初始液体体积，mL；V30为搅打30 min 后泡沫的体积，mL。

1.2.8.1 pH 对胶原蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响

设置pH 分别为4、5、6、7、8、9 这6 个水平，分别测定FE 和FS。

1.2.8.2 NaCl 浓度对胶原蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响 设置NaCl 溶液浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 mol/L 6 个水平，分别测定FE 和FS。

1.2.9 梅花鹿角盘胶原蛋白的乳化性和乳化稳定性

称量一定量梅花鹿角盘ASC 和PSC 冻干品溶解于0.05 mol/L Tris-HCI 缓冲液（pH7.5）中，取1 mL大豆色拉油与3 mL 0.5%胶原蛋白溶液，12000 r/min高速匀浆机乳化1 min，分别于0、10 min 时用移液枪吸取50 μL 乳浊液，加入到5 mL 0.1% SDS 溶液中混合均匀，于500 nm 处分别测定吸光度A0和A10，以0.1% SDS 溶液为空白对照。乳化活性指数（EAI）及乳化稳定指数（ESI）计算公式如下[18]。

式中：A0为0 min 时测得的吸光值；A10为乳化液10 min 后测定的吸光值；Δt 为10 min。

1.2.9.1 pH 对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响

设置pH 分别为4、5、6、7、8、9 这 6 个水平，分别测定EAI 和ESI。

1.2.9.2 NaCl 浓度对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响 设置NaCl 溶液浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mol/L 6 个水平，分别测定EAI 和ESI。

1.2.9.3 蛋白浓度对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响 设置胶原蛋白浓度分别为0.5%、1%、2%、3%和4% 5 个水平，分别测定EAI 和ESI。

1.3 数据处理

用Excel 2003 对数据进行处理（计算平均值和标准偏差等）及绘图；用SPSS Statistics 17.0 对数据进行显著性分析，通过Duncan 对平均数间的差异进行比较分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 梅花鹿角盘胶原蛋白分析鉴定

2.1.1 梅花鹿角盘胶原蛋白的氨基酸分析 由表3可知，鹿角盘通过不同方法制备的ASC 和PSC 的氨基酸组成极为相近，且含量丰富。占氨基酸残基总数最大的是甘氨酸。氨基酸总量为1000 时，分别占184、195。这是因为在氨基酸的序列中，甘氨酸是以重复序列存在，而且该序列一直循环存在于胶原蛋白中。因此通过结构式，可以判断出甘氨酸残基约占残基总数的33%；其次是苏氨酸；蛋氨酸含量最低。同时发现酪氨酸、组氨酸和异亮氨酸含量也很低，而且没有检测到胱氨酸。以上事实均证明实验所制备的胶原蛋白都符合Ⅰ型胶原蛋白氨基酸的模式构成[19]。

表3 梅花鹿角盘ASC 和PSC 的氨基酸组成（残基数/1000 个残基）Table 3 Amino acid composition of ASC and PSC from deer antler base (residues/1000 residues)

胶原蛋白的特征氨基酸是Pro 和Hyp 的总和。在总数为1000 氨基酸残基中，ASC 和PSC 中的脯氨酸分别为82 和87。同理，可计算羟脯氨酸分别为69 和75。Pro 在脯氨酰羟化酶羟基化作用后，胶原蛋白多肽链转录生成羟脯氨酸。ASC 和PSC 的脯氨酸羟基化程度分别为45.69%和46.30%。亚氨基酸（Pro 和Hyp 之和），同样在残基总数为1000 的情况下，ASC 和PSC 的残基中依次为151 和162。亚氨基酸是环状氨基酸，数量越多，需要破坏胶原蛋白主体结构的温度就越高。因此热稳定性就越好。所以胶原蛋白的热变性温度与亚氨基酸浓度有一定关联性[20]。因此与ASC 相比较，PSC 的热稳定性更好。

2.1.2 胶原蛋白SDS-PAGE 电泳分析 由图1 可知，鹿角盘ASC 和PSC 具有极相似的蛋白谱图，图中主要由α1 和α2、二聚体β链及三聚体γ链组成。而且α1 链的含量要远大于α2 链，二聚体β链含量较高，三聚体γ链含量较低。ASC 中β链和γ链的条带强度比PSC 稍高，可能是由于ASC 中含有较高比例的分子间或分子内的交联成分。相比于ASC，PSC 会有稍大的电泳迁移速率，这主要是因为胃蛋白酶会定位切割蛋白中端肽部位的肽，因此会使PSC 的分子量略小于ASC[21]。

图1 梅花鹿角盘ASC 和PSC 在还原和非还原条件下的SDS-PAGE 电泳图Fig.1 SDS-PAGE pattern of ASC and PSC from deer antler base under non-reducing and reducing conditions

比较还原和非还原条件下的蛋白电泳图，会发现不同条件下的条带几乎一样。可以得出β-巯基乙醇对ASC 和PSC 的SDS-PAGE 谱图无影响。胶原蛋白中不含有二硫键，这也印证了表3 的氨基酸组成的结论，即并没有检测到含硫氨基酸—Cys。

2.1.3 胶原蛋白傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析如图2 A、B 所示，除个别特征吸收峰存在吸收强度的微小差别外，二者的特征吸收峰基本一样。由酰胺A 谱可以证明三螺旋之间氢键的存在。酰胺Ⅰ谱带与蛋白的二级结构密切相关，同时跟酰胺Ⅲ带一起证明了三螺旋完整结构的存在[22]。因此，红外光谱图图谱也表明了鹿角盘胶原蛋白很好地保留了三螺旋构型，是后续理化性质准确测定的重要前提。

图2 梅花鹿角盘ASC（A）和PSC（B）的傅立叶变换红外光谱扫描图Fig.2 Fourier transform infrared spectroscopy of ASC (A) and PSC (B) from deer antler base

表4 为鹿角盘ASC 和PSC 的红外光谱的特征吸收峰位置及相关说明。由N-H 的伸缩振动而产生的酰胺A，其吸收峰一般出现在3400～3450 cm-1之间。一旦蛋白中的N-H 基团与氢键缔合，N-H 的伸缩振动便会向低频率移动，对应的波数会发生位移，一般在3300 cm-1左右[23]。FTIR 图谱表明，ASC 和PSC 分别位于3320.10、3316.58 cm-1处的吸收峰是由酰胺A 的N-H 的伸缩振动与氢键的缔合所引起的。酰胺A 与酰胺Ⅱ带的泛频耦合，即发生费米共振，分子中CH2 基团的不对称伸缩振动则会产生酰胺B 带[24]，一般出现在3000 cm-1附近。ASC 和PSC 酰胺B 的较弱吸收峰分别位于2975.57、2968.07 cm-1处。

表4 鹿角盘ASC 和PSC 的红外光谱吸收峰位置以及相关说明Table 4 Spectra peak locations of FTIR and assignment of ASC and PSC from deer antler base

在双键区（2000～1500 cm-1），酰胺Ⅰ谱带特征吸收波数通常在1625～1690 cm-1，是由C=O 伸缩振动引起，其吸收峰最强，ASC 和PSC 分别在1646.05、1631.44 cm-1处存在较强的吸收。C=O 的伸缩振动只取决于肽链的构型，不受肽链侧基的影响，故其对胶原的三螺旋结构较为敏感，与胶原蛋白的二级结构关系密切[25]。由异相N-H 面内弯曲振动和具有双键性质的C-N 伸缩振动共同作用产生的酰胺Ⅱ带，不易受肽链侧基影响[26]。ASC 和PSC 分别位于1552.84、1534.37 cm-1，因此它是由N-H 弯曲振动以及C-N 伸缩振动引起。酰胺Ⅲ是由N-H 变形振动所引起的，位于1200～1400 cm-1左右，是由于Gly 骨架和Pro 侧链的CH2摇摆振动所产生的，证明了胶原蛋白螺旋结构的存在[27]。ASC 和PSC 的N-H 的变形峰分别位于1244.66、1237.28 cm-1处。

2.1.4 胶原蛋白紫外扫描分析 由图3A、B 可知胶原蛋白在280 nm 处并无最大吸收峰，表明Try、Tyr 和Phe 等芳香族氨基酸的比例非常小，符合Ⅰ型胶原蛋白特征[28]。胶原蛋白肽键中存在羰基等生色基团。具体表现为在200～230 nm 有强吸收峰，219.0 nm 和224.0 nm 分别是鹿角盘ASC 和PSC的最大吸收峰处。二者最大吸收峰存在一定差异，可能是其氨基酸组成及结构不同所导致，与其他相关文献所报道中华鲟胶原蛋白的紫外光谱在230 nm 处左右达到最大吸收峰值结论相一致[29]。

图3 梅花鹿角盘ASC（A）和PSC（B）的紫外吸收光谱图Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of ASC (A) and PSC (B)from deer antler base

2.2 梅花鹿角盘胶原蛋白理化性质分析

2.2.1 梅花鹿角盘胶原蛋白的溶解度

2.2.1.1 pH 对胶原蛋白溶解度的影响 比较pH 分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0 时对胶原蛋白溶解度的影响，结果如图4 所示。通过实验测定，ASC 等电点是6.4±0.1，PSC 等电点是6.9±0.1。ASC和PSC 的溶解度均在pI 附近达到最低值。因为当pH 处于pI 时，胶原蛋白主要以两性离子状态存在，静电荷为零，相邻蛋白质分子间的静电力最小，使蛋白质分子易于结聚而产生沉淀，因此溶解度最低（P<0.05）。当 pH 分别为 4 和 10 时，ASC 和 PSC 溶解性均较好（P<0.05），这是因为此时胶原蛋白分子自身带有一定量的正电荷或负电荷，呈现出复杂的阳离子或阴离子状态，分子之间存在互相排斥力，阻止了单分子结聚成沉淀物，从而使胶原蛋白分子具有良好的分散性，溶解度也随之增大[30]。

图4 pH 对梅花鹿角盘ASC 和PSC 溶解度的影响Fig.4 Effect of pH on solubility of ASC and PSC from deer antler base

2.2.1.2 NaCl 浓度对胶原蛋白溶解度的影响 将配制好的梅花鹿角盘ASC 和PSC 溶液5 mL 与浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和3.0 mol/L 的NaCl溶液混合后，比较其溶解度的变化，结果如图5 所示。当NaCl 浓度为0～2 mol/L 时，增加盐量可以增大胶原蛋白在水中的溶解度，即“盐溶”现象[31]。此时盐浓度对PSC 溶解度的影响显著大于对ASC 的影响（P<0.05），使其所带的正电荷逐渐增强，增大了相互间的排斥力，蛋白质的结构趋于稳定且具有较好的分散性，增大了胶原蛋白的溶解度[32]。当NaCl 浓度大于2 mol/L 时，二者的溶解度均随盐浓度的增大而下降，即“盐析”现象。这是因为盐类解离出的高浓度的盐离子，同周围水分子结合形成一层水化膜，降低了胶原蛋白的水合作用，引发脱水而析出沉淀，从而减小了胶原蛋白的溶解度（P<0.05）[33]。

图5 NaCl 浓度对梅花鹿角盘ASC 和PSC 溶解度的影响Fig.5 Effect of NaCl concentration on solubility of ASC and PSC from deer antler base

2.2.2 梅花鹿角盘胶原蛋白的起泡性和泡沫稳定性

2.2.2.1 pH 对胶原蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响

比较pH 分别为4、5、6、7、8 和9 时，对胶原蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响，结果如图6 所示。梅花鹿角盘ASC 和PSC 在接近pI（6.4±0.1 和6.9±0.1）时，两者所形成的泡沫体系很稳定（P<0.05）。这是由于胶原蛋白分子间的排斥力很小，静电吸引作用却很大，会提高被吸附在气/液界面上蛋白膜的厚度和硬度，利于蛋白与蛋白之间的相互作用及蛋白在膜上的吸附作用，从而形成黏稠的吸附膜，提高胶原蛋白的起泡性和泡沫稳定性[34]。即使胶原蛋白在pI 处不溶解，只有很少的蛋白参与泡沫形成，泡沫稳定性仍然可以提高。因为不溶部分的胶原蛋白对泡沫形成虽然没有贡献，但却可以增加蛋白膜的黏度，从而间接提高泡沫稳定性。在非pI 时，ASC 和PSC 其泡沫稳定性显著降低（P<0.05）。

图6 pH 对梅花鹿角盘ASC 和PSC 起泡性和泡沫稳定性的影响Fig.6 Effect of pH on foam expansion and stability of ASC and PSC from deer antler base

2.2.2.2 NaCl 浓度对胶原蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响 比较NaCl 溶液浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 mol/L 时，对胶原蛋白起泡性和泡沫稳定性的影响，结果如图7 所示。NaCl 的添加可提高梅花鹿角盘ASC 和PSC 的起泡性能，可能是其有助于提高胶原蛋白溶液黏度的原因。当NaCl 浓度为0.5～1.5 mol/L 时，钠离子能同蛋白中的羧基形成盐桥而显著降低了胶原蛋白泡沫的稳定性（P<0.05）[35]。

图7 NaCl 浓度对梅花鹿角盘ASC 和PSC 起泡性和泡沫稳定性的影响Fig.7 Effect of NaCl concentration on foam expansion and stability of ASC and PSC from deer antler base

2.2.3 梅花鹿角盘胶原蛋白的乳化性和乳化稳定性

2.2.3.1 pH 对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响

比较pH 分别为4、5、6、7、8 和9 时对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响，结果如图8 所示。梅花鹿角盘ASC 和PSC 的pH 处于pI 时，其乳化能力和乳化稳定性达到最低值（P<0.05），偏离pI 时，均具有较高的乳化性和乳化稳定性，PSC 的乳化性略高于ASC，可能是因为PSC 的氨基酸侧链发生解离，产生了静电斥力，利于乳浊液的稳定。ASC 的乳化稳定性高于PSC，可能因为此时的条件有利于胶原蛋白的溶解，并提高胶原蛋白对水的结合能力，进而提高了蛋白膜的乳化稳定性[36]。

图8 pH 对梅花鹿角盘ASC 和PSC 乳化性和乳化稳定性的影响Fig.8 Effect of pH on emulsifying activity and stability of ASC and PSC from deer antler base

2.2.3.2 NaCl 浓度对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响 比较NaCl 溶液浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mol/L 时，对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响，结果如图9 所示。适当的NaCl 浓度会降低胶原分子间的斥力，促进盐溶，从而进一步提高胶原蛋白的乳化性和乳化稳定性；但当NaCl 浓度过大时，电离后的离子会降低乳液表面电位，斥力能垒也随之下降，反而会对乳化性和乳化稳定性产生不利影响。在NaCl 浓度在0～0.4 mol/L 范围内，能促进梅花鹿角盘ASC 和PSC 溶解能力的提高，造成乳化性和乳化稳定性呈显著增加的趋势（P<0.05）；当浓度大于0.4 mol/L 时，梅花鹿角盘ASC 和PSC 的乳化性和乳化稳定性随NaCl 浓度的增大而缓慢下降（P<0.05）[37]。

图9 NaCl 浓度对梅花鹿角盘ASC 和PSC 乳化性和乳化稳定性的影响Fig.9 Effect of NaCl concentration on emulsifying activity and stability of ASC and PSC from deer antler base

2.2.3.3 蛋白浓度对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响 比较蛋白浓度分别为0.5%、1%、2%、3%、和4%时，对胶原蛋白乳化性和乳化稳定性的影响，结果如图10 所示。在蛋白浓度0.5%～2%时，梅花鹿角盘ASC 和PSC 的乳化性显著增大（P<0.05）。浓度大于2%时，增长幅度缓慢，基本保持平稳状态（P>0.05）。这是因为当蛋白浓度超过一定值，吸附层不再有明显变化，使得膜厚度和强度增加幅度减小[38]。相反ASC 和PSC 的乳化稳定性随着蛋白浓度的增大而降低，在蛋白浓度0.5%时，两者的乳化稳定性最大，蛋白浓度4%时，两者的乳化稳定性最小（P<0.05）[39]。

图10 蛋白浓度对梅花鹿角盘ASC 和PSC 乳化性和乳化稳定性的影响Fig.10 Effect of collagen concentration on emulsifying activity and stability of ASC and PSC from deer antler base

3 结论

梅花鹿角盘ASC 和PSC 符合Ⅰ型胶原蛋白氨基酸的特征分布。其中蛋氨酸含量最低。ASC 和PSC 的羟基化程度较高，分别为45.69%和46.30%。ASC 和PSC 至少由两条α链（α1 和α2）组成，β链含量较高，并含有少量的γ链。胶原蛋白分子量约为110 kDa，说明鹿角盘胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白且达到电泳纯。ASC 和PSC 二级结构相似，均出现酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的特征吸收峰，保存着三螺旋结构。ASC 和PSC 在280 nm 处基本无吸收。其最大吸收峰位于219.0 nm 和224.0 nm 处。ASC 和PSC溶液的pH 越接近胶原蛋白pI，蛋白溶解性越小。当NaCl 浓度为0～2 mol/L 时，发生“盐溶”现象，ASC 和PSC 的溶解度随盐浓度增大而提高；浓度大于2 mol/L 时，出现“盐析”现象，溶解度反而下降。梅花鹿角盘ASC 和PSC 溶液的pH 越接近pI，其乳化能力和乳化稳定性越小。当NaCl 浓度为0～2 mol/L 时，增加盐量可以增大ASC 和PSC 的溶解性、起泡性；盐浓度在0～0.4 mol/L 范围内，能提高ASC 和PSC 乳化性和乳化稳定性。蛋白浓度0.5%时，两者的乳化稳定性最大，蛋白浓度4%时，两者的乳化稳定性最小。梅花鹿角盘胶原蛋白结构及理化性质的研究为产品的开发奠定了理论基础。