椰毒假单胞菌酵米面亚种产毒差异蛋白质组学分析

黄秀丽 ，沈 圣，朱文娟，陈佳平，陈国培，赵智锋，黄永德，陈嘉聪，温晓裕

（1.惠州市食品药品检验所，广东惠州 516003；2.惠州市市场监督管理信息中心，广东惠州 516003；3.深检集团（深圳）医学检验实验室，广东深圳 518131）

椰毒假单胞菌酵米面亚种（Pseudomonas cocovenenanssubsp.farinofermentans，简称椰毒假单胞菌），属于唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）致病变种，它容易在酵米面制品、淀粉制品及变质的木耳或银耳等食物中生长，在适宜的温湿度条件下短时间内即可产生大量的米酵菌酸毒素，误食后会引发严重食物中毒甚至死亡[1-2]。椰毒假单胞菌是一种高致死性的食源性致病菌，米酵菌酸毒素是主要致死因子，探讨该菌米酵菌酸毒素产生机制，对于有效防控由该菌引起食物中毒事件的发生具有重要指导意义[3-8]。

国内外针对椰毒假单胞菌米酵菌酸毒素产生机制及致病机理等方面的研究均有报道[8-11]，尤其是近年来随着分子生物学技术的发展，利用基因测序技术从基因组水平揭示米酵菌酸毒素产生机制，发现米酵菌酸毒素产生与bon基因簇有关[12-13]。产毒株中存在较完整的bon基因簇，而非产毒株中存在该基因簇的缺失，推测是同源重组导致[13]。利用蛋白质组学技术从蛋白质组水平探讨米酵菌酸毒素产生机制的研究还未见报道。

目前基于多组学包括基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等技术开展致病菌产毒机制及致病机理的研究报道较多[13-16]，采用多组学技术可以从基因、蛋白和通路等多个分子水平进行综合分析，更深入地探讨相关分子机制。本研究对3 株椰毒假单胞菌完成了基因测序基础上[13]，利用DDA 非标记定量蛋白质组学技术对菌株产毒培养前后差异表达蛋白进行分析，试图找到产毒相关蛋白，从蛋白质水平探讨米酵菌酸毒素产生机制。利用多组学技术探讨米酵菌酸毒素产生机制，可为酵米面制品、淀粉制品等食品生产企业、餐饮企业有效防控由椰毒假单胞菌导致的食品安全风险，进而更好地控制其危害提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株YD、YF、YM 分别从泰国碎白米、东北云耳以及缅甸碎白米中分离且鉴定为产米酵菌酸毒素的椰毒假单胞菌（P.cocovenenanssubsp.farinofermentans），即产毒株；唐菖蒲伯克霍尔德氏菌CICC 10574（B.gladioli，自命名为菌株BL）为不产生米酵菌酸毒素的对照菌株，即非产毒株 购于中国工业微生物菌种保藏中心；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（批号11110101）、马铃薯葡糖糖半固体琼脂培养基（批号1101651）广东环凯微生物科技有限公司；米酵菌酸对照品 上海安谱公司，纯度≥95%；QuEChERS dSPE EMR-Lipid 增强型脂质去除净化管 广州安捷伦科技公司；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）美国沃特世；Bradford 蛋白定量试剂盒（批号P0006）碧云天。

B80-1600‖A2 生物安全柜 苏州安泰空气技术有限公司；BSP-400 型生化培养箱 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；GT-2227QTS 型智能超声波清洗仪 广东固特超声股份有限公司；Fotector Plus 型高通量全自动固相萃取仪 厦门睿科集团股份有限公司；LCMS-8040 三重四级杆液质联用仪 日本岛津公司；EASY-nLC1200 纳升液相色谱仪、Orbitrap exploris 480 高分辨质谱仪 赛默飞世尔科技中国。

1.2 实验方法

1.2.1 产毒培养 参照GB 4789.29-2020 进行产毒试验[17]。将试验用菌株YD、YF、YM 以及BL 分别接种于PDA 培养基上，（36±1）℃培养24～36 h 活化。用灭菌接种环刮取适量菌苔，加到3 mL 无菌生理盐水的试管中，配成1 麦氏浓度（MCF）的菌悬液（约108CFU/mL），用无菌吸管吸取0.5 mL，滴在铺好无菌玻璃纸的直径150 mm 马铃薯葡萄糖半固体平板上，用无菌L 棒涂布均匀，于（26±1）℃培养5 d。无菌吸管吸取0.5 mL 无菌生理盐水作为空白对照。

1.2.2 毒素含量测定 毒素制备参考文献[18]。将产毒培养后的马铃薯葡萄糖半固体琼脂转移至三角瓶，100 ℃流动蒸汽灭菌30 min，室温冷却后置于-20 ℃冰箱冷冻过夜，第2 d 取出三角瓶置室温融化，用无菌吸管吸出冻融液，经滤纸过滤至无菌试管或锥形瓶中即为毒素粗提液。取5 mL 毒素粗提液于50 mL 离心管中，加入2 倍体积的80%甲醇水溶液，超声提取10 min，离心后吸取上清液进行净化处理。取5 mL 上清液于装有dSPE EMR-Lipid 吸附剂的净化柱中，涡旋2 min 后离心，取2 mL 上清液于40 ℃水浴中氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，0.22 μm有机滤膜过滤后测定。

毒素测定参考文献[18]。标准溶液配制：准确称取米酵菌酸标准品10 mg（精确至0.01 mg），用甲醇溶解后转移至100 mL 容量瓶中，用甲醇定容，终浓度为0.1 mg/mL。色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：2 µL；梯度洗脱程序为：0～1.5 min，B：20%；1.5～2.5 min，B：20%～95%；2.5～5.0 min，B：95%；5.0～6.0 min，B：95%～20%；6.0～7.0 min，B：20%。质谱条件：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）；负离子扫描模式；DL 管温度为250 ℃；加热器温度为400 ℃；雾化气流量为3 L/min；干燥气流量为15 L/min；其他质谱参数见表1。

表1 米酵菌酸的质谱参数Table 1 Chromatogram parameters of bongkrekic acid

1.2.3 蛋白质组学分析 菌体收集：产毒培养结束后将带菌的玻璃纸放入灭菌的50 mL 离心管中，加入30 mL 无菌生理盐水，振荡5 min，用灭菌后的镊子取出玻璃纸，离心管10000 g 离心10 min，弃去上清液，再加入30 mL 无菌生理盐水，振荡后离心，重复2～3 次，沉淀即为收集的菌体。试验重复3 次，每次3 个平行，每3 个平行样混合为1 个样本，用于蛋白质样本制备。

样品前处理为课题组自建方法，具体操作如下：称取100 mg 样本，加入500 µL 尿素裂解液（尿素8 mol/L，tris 50 mmol/L，含1×蛋白酶抑制剂，pH8.0），样本在冰水浴中用探头式超声仪超声10 min（超3 s，停2 s，功率30%）至溶液变澄清；超声处理后的样品于4 ℃下20000×g 离心15 min，取上清480 µL至新的离心管，使用Bradford 蛋白定量试剂盒定量，加50 mmol/L 碳酸氢铵稀释样本，使蛋白浓度约5 µg/µL 左右；加1 mol/L 二硫苏糖醇（DTT）到样本中，终浓度为10 mmol/L，37 ℃孵育1 h；样本冷却至室温，加1 mol/L 碘乙酰胺（IAA）至终浓度为20 mmol/L，室温避光孵育1 h；样本全部转移至FASP 超滤管中14000×g 离心15 min，加入200 µL 50 mmol/L 碳酸氢铵，14000×g 离心15 min，除去收集管中废液，重复2 次；超滤管放到新EP 管上（封口膜密封接口处），加入100 µL 50 mmol/L 碳酸氢铵和2 µL trypsin，37 ℃孵育12～16 h；14000×g 离心15 min 收集肽段，加100 µL H2O，14000×g 离心15 min，以彻底收集肽段；加入20%甲酸至终浓度0.5%，冰上静置15 min 终止酶解；在含有抽干肽段的离心管中加40 μL 0.1%甲酸水溶液，剧烈涡旋5 min 充分溶解肽段，4 ℃下20000×g 离心30 min，取上清35 µL 于新的离心管；使用nanodrop 测定肽段浓度，用0.1%甲酸水溶液调节其浓度到500 ng/µL。

液相色谱条件：色谱柱：C18自制柱（内径：100 µm，长度30 cm）；流动相：A：0.1%甲酸水；B：20%乙腈水+0.1%甲酸；梯度洗脱程序：0～95 min，B：5%～40%；95～113 min，B：40%～50%；113～115 min，B：50%～90%；115～120 min，B：90%；流速：300 nL/min；上样量：500 ng。质谱条件：一级质谱参数为分辨率：60000；扫描范围（m/z）：350～1500；射频透镜（%）：50；自动增益控制目标（%）：300；最大累积时间（ms）：20；电荷价态范围：2～7；动态排除模式：排除前1 次扫描，排除时间持续60 s，强度阈值：5e4；二级质谱参数为隔离窗口（m/z）：1.6；碰撞能（%）：30；分辨率：15000；自动增益控制目标（%）：标准模式；最大累积时间（ms）：22。

1.3 数据处理

采用MaxQuant 软件（version 2.0.3.1）对DDA质谱数据进行搜索鉴定，数据库为Uniprot（Burkholderia gladioli），蛋 白FDR（假阳性率）<0.01 的为鉴定成功。数据的统计分析主要由R 软件（Version 4.0）完成，显著差异蛋白分析由R 包metaX 完成。产毒前后显著性差异蛋白的筛选主要通过单变量分析来计算。菌株产毒培养前的2 次重复蛋白表达量平均值作为一个变量（D（菌株YD）/F（菌株YF）/M（菌株YM）/L（菌株BL）），产毒培养后3 次重复蛋白表达量平均值作为一个变量（CD（菌株YD）/CF（菌株YF）/CM（菌株YM）/CL（菌株BL）），差异倍数FC（Fold change）则为CD:D、CF:F、CM:M 和CL:L 的比值。当FC≥1.5 且T检验统计显著性P-value≤0.05 则为上调（up-regulated），FC≤0.67且P-value≤0.05 的则为下调（down-regulated）[19-20]。采用BLAST 软件与KEGG 数据库比对，设置Evalue<1e-5，从而注释到每个鉴定蛋白的通路。

2 结果与分析

2.1 显著性差异蛋白的统计

利用DDA 非标记定量蛋白质组学技术对4 个菌株产毒培养前后菌体蛋白质进行分析。共鉴定到38161 条序列，4420 个蛋白。产毒培养后菌株米酵菌酸毒素产生情况（结果表示为平均数±标准差）及鉴定蛋白统计见表2。

产毒培养5 d 后，菌株YD、YF、YM 及BL 中较接种前显著性差异表达蛋白统计见图1。产毒菌株YD 上调表达蛋白为254 个，下调表达为235 个；产毒菌株YF 上调表达蛋白为228 个，下调表达为410 个；产毒菌株YM 上调表达蛋白为238 个，下调表达为313 个；标准菌株BL 上调表达蛋白为135 个，下调表达为330 个。产毒培养后，产毒菌株YD、YF 及YM 中上调表达的蛋白在228～254 个之间，均明显多于标准菌株BL，下调表达的蛋白则菌株YD 低于菌株BL，而菌株YF 高于菌株BL，菌株YM 与菌株BL 较接近。

图1 不同菌株产毒培养后显著性差异表达的蛋白Fig.1 Significantly differentially expressed proteins of different strains after toxin-producing culture

2.2 显著性差异蛋白的功能注释

本研究利用多个功能数据库（GO、Pathway、Reactome 等）对鉴定到的蛋白进行功能注释，以期揭示显著性差异蛋白功能分类。其中KEGG PATHWAY 数据库中将生物代谢路径划分为6 类。产毒培养后菌株YD、YF、YM 及BL 中显著性差异表达蛋白参与代谢路径统计见表3。差异表达的蛋白中，参与新陈代谢路径蛋白占比最多，占71.86%，如碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅助因子和维生素代谢、脂质代谢等；其次为参与遗传信息传递蛋白，占9.70%，如翻译、折叠、分类和降解以及复制、修复等；参与人类疾病蛋白也较多，占9.51%，如耐药性等；再其次为参与生物体系统蛋白，占5.61%，如衰老、免疫系统等；参与细胞过程蛋白，占2.00%，如运输和分解代谢等；参与环境信息处理蛋白最少，占1.33%，如信号转导等。

表3 显著性差异蛋白参与代谢路径统计Table 3 Significant difference in protein participation in metabolic pathway statistics

2.3 产毒株与非产毒株间显著性差异蛋白分析

为了从蛋白质水平探索米酵菌酸毒素产生机制，对产毒株与非产毒株产毒培养前后差异表达蛋白进行了分析。产毒培养后，在3 株产毒株中均显著性上调表达蛋白为30 个，其中有5 个蛋白在非产毒株BL 中也上调表达，故选取仅在产毒株产毒过程中显著性上调表达的25 个蛋白进行分析（见表4）。产毒培养后，在3 株产毒株中均显著性下调表达蛋白为65 个，其中34 个蛋白在非产毒株BL 中也下调表达，故选取仅在产毒株产毒过程中显著性下调表达的31 个蛋白进行分析（见表5）。产毒培养后，未找到在产毒株中显著性上调表达而在非产毒株中显著性下调表达或者在产毒株中显著性下调表达而在非产毒株中显著性上调表达的蛋白。

表4 产毒培养后在产毒株中显著性上调表达的蛋白Table 4 Proteins significantly up-regulated in toxin-producing strains after toxin-producing culture

表5 产毒培养后在产毒株中显著性下调表达的蛋白Table 5 Proteins significantly down-regulated in toxin-producing strains after toxin-producing culture

产毒培养后，仅在产毒株中显著性上调表达蛋白有25 个，包括参与抗生素、氨基酸合成的二氢吡啶二羧酸合成酶、二羟基酸脱水酶，参与氨基酸代谢的过氧化氢酶、酰胺水解酶，参与淀粉和蔗糖代谢的α淀粉酶家族蛋白，参与氮素代谢的碳酸酐酶，参与磷酸肌醇代谢的Io1C 蛋白等。与细菌趋化性相关蛋白有核糖ABC 转运蛋白、反应调节受体蛋白、甲基受体趋化性蛋白II 等，鞭毛组件包括鞭毛P 环蛋白、鞭毛M 环蛋白、鞭毛钩蛋白FlgE，鞭毛是细菌移动和趋化性的运动器官，同时与细菌致病性也密切相关[21]。此外，与群体感应、毒素产生相关的转录调节因子LysR 家族蛋白（F2LH04）也在产毒培养后显著性上调表达。除上述蛋白外，还有5 个未知蛋白也在产毒培养后显著性上调表达。

产毒培养后，仅在产毒株中显著性下调表达蛋白有31 个，包括参与萜类骨架及萜类生物合成的角鲨烯-蒎烯环化酶、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶、4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶，参与淀粉和糖类代谢的CDP-6-脱氧-δ-3，4-葡萄糖还原酶、UDP-N-乙酰烯醇丙酮酰葡糖胺还原酶、UTP -葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，参与氨基酸代谢的多胺氨丙基转移酶、氨甲酰磷酸合酶、磷酸组氨醇转氨酶，还有参与叶酸生物合成的GTP 3’，8-环化酶、GTP 环化水解酶FolE2，与核糖体相关的50S 核糖体蛋白L31 型B、30S 核糖体蛋白S2。转录调节因子LysR 家族蛋白（F2LAQ5）在产毒培养后其表达量降低。除上述蛋白外，还有4 个未知蛋白也在产毒培养后显著性下调表达。

3 讨论

本研究应用DDA 非标记定量蛋白质组学技术对椰毒假单胞菌（产毒株）与非产毒株产毒培养前后差异表达的蛋白进行分析，旨在从蛋白质水平探索米酵菌酸毒素产毒机制。通过对产毒株与非产毒株产毒培养前后差异蛋白分析，筛选到56 个显著性差异蛋白，其中包括上调蛋白25 个，下调蛋白31 个。这些蛋白中有参与抗生素合成、氨基酸合成与代谢、淀粉和糖代谢、能量代谢等相关蛋白，也有与生物膜形成、群体感应、毒素产生、胁迫响应等相关蛋白，还有一些功能未知蛋白。产毒培养后，产毒株中显著性上调表达的25 个蛋白中，有6 个蛋白与细菌趋化性相关，占比较高，基于趋化性与病原菌致病性等相关研究的报道[21-24]，推测趋化性可能在椰毒假单胞菌米酵菌酸毒素产生过程中发挥重要作用。

趋化现象在运动性细菌中普遍存在，细菌通过受体蛋白感知环境信号，随后调整鞭毛运动方向来趋利避害进而得以存活下来[22]。有研究发现趋化性与病原菌致病性相关，在病原菌定殖和侵染过程中发挥重要作用，趋化性和运动性增强了病原菌的侵染力，运动和趋化突变体导致致病性明显减弱[23-24]。了解趋化性在细菌致病机理中的作用，可为通过趋化性控制细菌侵染、减少病害发生提供理论依据。此外，有些细菌对环境污染物如芳香族化合物、硫化物等具有趋化性，越来越多的研究结果显示趋化性与降解性紧密相关，细菌趋化性在环境污染治理、生物修复中也发挥重要作用[25-26]。

趋化运动在伯克霍尔德菌（Burkholderia）中也普遍存在。伯克霍尔德菌利用趋化性寻找盘基网柄菌宿主以维持共生关系[27]。洋葱伯克霍尔德氏菌G4对甲苯、三氯乙烯、和维生素C 等具有趋化性[28]。伯克霍尔德氏菌SJ98 对氯代芳香族化合物具有趋化性等[29]。椰毒假单胞菌是唐菖蒲伯克霍尔德菌中的致病变种，趋化性与该菌致病性等相关研究还未见报道。基于趋化性与细菌致病性相关研究的报道，以及本研究发现产毒培养后产毒株中趋化性及鞭毛运动性相关蛋白表达量显著增加现象，推测趋化性可能在椰毒假单胞菌米酵菌酸毒素产生过程中发挥重要作用，后续可开展趋化性与该菌米酵菌酸毒素产生及致病相关机理研究。

此外，椰毒假单胞菌产毒培养后，基质中可检测到高含量的米酵菌酸毒素，该毒素为一种脂肪酸类物质，有研究报道磷脂类和不饱和长链脂肪酸类可引起假单胞菌（Pseudomonas）负趋化运动[30]，米酵菌酸毒素是否作为负趋化物，介导了椰毒假单胞菌的趋化性运动以躲避有害环境进而攫取营养产生更多的米酵菌酸毒素，后续还需进一步实验确证，比如通过电镜观察毒素产生过程是否发生鞭毛着生方式的变化，通过游动平板法等方式观察产毒培养过程中是否会发生运动方式的改变以及群集趋化性反应等。通过了解趋化性在椰毒假单胞菌米酵菌酸毒素产生及致病过程中的作用，后续可以通过趋化性控制细菌感染及毒素产生，进而为减少由该菌引起的食品安全事故的发生提供理论依据。

4 结论

通过对椰毒假单胞菌产毒培养前后差异蛋白质组学分析，筛选出了56 个仅在产毒株中显著性差异表达蛋白，这些蛋白参与抗生素合成、氨基酸代谢、群体感应、趋化性以及毒素产生等活动。趋化性在运动细菌中普遍存在，产毒培养后产毒株中趋化性信号受体蛋白以及鞭毛组件蛋白表达量显著增加，推测趋化性运动可能在米酵菌酸毒素产生过程中发挥重要作用，米酵菌酸毒素是否作为趋化物介导了椰毒假单胞菌趋化性运动以趋利避害进而更有利于米酵菌酸毒素的产生，还需进一步确证。