保和丸对溃疡性结肠炎小鼠肠道内A.muciniphila菌的调节作用*

游丰锋 杨光勇 涂小华 何亚敏 喻良锦 李雨彤 何光志

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC) 是一种临床常见的慢性疾病,据《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见(2017)》[1],UC黏液脓血便的临床表现及反复发作、迁延难愈的疾病特点,属于中医“久痢”范畴。药理研究表明,保和丸主要有助消化、调节肠胃功能、抗溃疡和抑菌的作用[2]。保和丸是由焦山楂、神曲、莱菔子、茯苓、法半夏、陈皮、连翘7味药组成,既有消食化滞、行气和胃之功,又有清热散结之效,使食积得消,胃气得和,湿热得去。临床研究发现,保和丸常用于急慢性胃炎、急慢性肠炎、消化不良、婴幼儿腹泻等属食积内停者。

嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila,A.muciniphila)是肠道微生态系统数千种共生菌中,对机体生理机能起重要作用的肠道优势菌群之一,属专性厌氧菌,占3%～5%。主要定殖于盲肠与结肠,其代谢产物之一的丙酸对肠道免疫稳态具有调节作用,在多种疾病如糖尿病、肥胖症、溃疡性结肠炎、结肠癌等均起到关键作用[3]。

本研究主要从A.muciniphila菌角度探讨保和丸对UC小鼠的作用机制,通过其与传统药物5-氨基水杨酸对比,用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR, RT-PCR)对各组结果进行绝对定量分析,探究保和丸对该菌在UC疾病中的影响,为UC的临床治疗提供参考。

1 材料与仪器

1.1 实验动物清洁级6周龄昆明(KM)小鼠40只,雌雄各半,体质量(20±2)g,购买于长沙市天勤生物技术有限公司,许可证号:SCXK(湘)2019—0014。

1.2 实验试剂与药品右旋葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulphate Sodium, DSS, Sigma-Aldrich公司,批号:H02J9B62777);中成药保和丸(北京同仁堂,批号:18081639);5-氨基水杨酸(莎尔福公司,批号:17G27518L);粪便基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司,批号:S7516);2×预混实时荧光定量快速PCR反应体系(2×RealStar Green Fast Mixture)(批号:9AG01,GeneStar 公司)。

1.3 主要仪器CFX96TM实时PCR检测仪(BIO-RAD, 美国),核酸浓度检测仪(Thermo Fisher Scientific, 美国)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组造模与给药将40只小鼠随机分为正常组、模型组、5-氨基水杨酸组、保和丸组,每组10只。根据参考文献[4-6],除正常组外,其他组小鼠均以3%葡聚糖硫酸钠溶液灌胃7 d,制备小鼠UC模型。参考《药理实验方法学》[7]体表面积计算剂量方法,5-氨基水杨酸配制成6.5 mg/ml的药液,3次/d灌胃给药;同时,将保和丸按上述方法,配制成78 mg/ml的药液,2次/d灌胃给药。正常组和模型组按0.1 ml/10 g灌胃给药,2次/d,每次0.2 ml,连续14 d。

1.4.2 粪便总DNA提取在实验第15天清晨,收集各组小鼠新鲜粪便,按照粪便基因组DNA试剂盒说明书,提取总DNA,核酸浓度检测仪测定提取DNA模板的纯度及浓度,保留DNA纯度A260/A280 比值在1.8左右的样本,调整各样本浓度在200 ng/μl左右,-20 ℃保存备用。

1.4.3 RT-PCR标准品目的DNA的制备根据参考文献[8],委托上海生工生物工程有限公司合成引物,P1:5′-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3′,P2:5′- CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3′。用正常组DNA进行PCR扩增,回收目的条带扩增产物交由上海生工进行克隆测序,基因长度包含329碱基对(bp),对应Gene-Bank(NR_042817.1)无差别,委托上海生工抽提该克隆菌质粒作为荧光定量PCR标准品。计算标准品目的DNA的拷贝数,0.5 ng/μl 浓度20 μl体系PCR的拷贝数约为2.0×108copies/μl。

1.4.4 实时荧光定量RT-PCR检测标准品0.5 ng/μl质粒稀释10倍作为扩增模板,模板2 μl(5 ng/μl),P1、P2各0.3 μl(10 μmol/L),2×RealStar Green Fast Mixture 10 μl,超纯水(dd H2O)补充体系至20 μl。RT-PCR程序设置:95 ℃(10 min)、95 ℃(15 s)、60 ℃(40 s)、72 ℃(30 s),循环39次,于72 ℃采集荧光信号,溶解曲线默认设置(65～95 ℃,0.5 ℃/5 s递增)。标准曲线:标准品0.5 ng/μl采用10倍梯度稀释3复孔法,7个梯度稀释,添加无模板对照(NTC),CFX96TM实时PCR检测仪运行标准曲线程序,检验方法的灵敏度。

1.4.5 特异性检测本实验室保存有Lactobacillus,Glucococcusaureus,Escherichiacoli,Bifidobacterium,Enterococcus,Bacteroides等菌属可用于特异性检测,A.muciniphila菌为阳性对照。

1.5 统计学分析采用BIO-RAD CFX96TM实时PCR检测仪自带软件进行ΔCt分析,以正常组(Blank control)作为对照,每组8个样本,3个复孔。

2 结果

2.1 标准曲线的制备及方法灵敏度梯度范围(2.0×108copies/μl)～(2.0×102copies/μl),3个平行复孔重复,结果呈指数增长。见图1。熔解曲线峰值在87.5 ℃且均为单个峰。见图2。NTC表现出个别杂峰,Cq值≈31,提示灵敏度为2.0×102copies/μl。R2=0.998,斜率-3.464符合标准(MIQE指南[9]),截距38.666,扩增效率94.4%符合标准(MIQE指南90%～105%)。标准曲线横坐标为DNA拷贝数,纵坐标为Cq值。见图3。线性关系为Cq=-3.464×lgX+38.666,即X=10^[(Cq - 38.666)/ -3.464],其中X为RT-PCR结果对应的拷贝数copies/μl,线性良好。

图1 A.muciniphila菌RT-PCR灵敏度实验扩增曲线

图2 A.muciniphila菌RT-PCR灵敏度实验熔解曲线

图3 A.muciniphila菌RT-PCR灵敏度与重复性实验标准曲线

2.2 特异性阴性样本表现扩增非特异性现象。见图4。阳性对照样组A.muciniphila菌表现特异性扩增,熔解曲线。见图5。显示A.muciniphila菌曲线峰值高突,证明方法具有良好的特异性。

图4 A.muciniphila菌RT-PCR特异性实验扩增曲线

图5 A.muciniphila菌RT-PCR特异性实验熔解曲线

2.3 RT-PCR绝对定量结果各组扩增结果呈指数增长期曲线平行。见图6。熔解曲线除NTC显示无扩增外,各组峰值在87.5 ℃,特异性高尖单峰。见图7。ΔCt分析显示,以正常组(Blank control)为组间参照时保和丸组(Baohe pills)的相对值明显升高,5-氨基水杨酸组(Mesalazine)稍有降低,模型组(Model control)有一定升高;Cq值均值对应的拷贝数/μl提示与正常组比较,保和丸组的A.muciniphila细菌拷贝数显著升高,模型组拷贝数较之约升高1倍,5-氨基水杨酸组拷贝数略有降低。见表1。各组样本Cq值箱线图显示正常组内差异无统计学意义,模型组和5-氨基水杨酸组各自组内差异无统计学意义,模型组和保和丸组组内差异有统计学意义,但不超过0.5,符合MIQE指南[9],可以进行相关分析。见图8。

表1 各组小鼠RT-PCR绝对定量结果

图6 A.muciniphila菌RT-PCR各组实验扩增曲线

图7 A.muciniphila菌RT-PCR各组实验熔解曲线

图8 各组样本Cq值箱线图

3 讨论

溃疡性结肠炎的病机为本虚标实,湿(热)、毒、痰、瘀等为主要病理因素,保和丸中山楂消肉食之积,神曲化谷物之积,莱菔子消痰浊之积,半夏、陈皮行气化滞,茯苓健脾渗湿,连翘清热散结。对于脾虚湿蕴夹杂食积者,可用参苓白术散合保和丸加减消食导滞[10]。药理研究表明,保和丸主要有助消化、调节肠胃功能、抗溃疡和抑菌的作用[2],能促进双歧杆菌目菌群数量[11],还可促进梭菌目、脱硫弧菌目、产氢细菌目菌群数量,同时减少红蝽菌目、拟杆菌目、芽孢杆菌目、乳杆菌目、丹毒丝菌目、伯克氏菌目、气单胞菌目、疣微菌目菌群数量[12]。说明保和丸有一定选择性抑菌作用,但其对UC菌群紊乱的调节作用机制尚不明确。

A.muciniphila菌通过多种机制维持肠道稳态。它能将黏蛋白分解,刺激杯状细胞合成黏蛋白,从而达到动态平衡,维持肠道黏膜屏障稳定[13]。A.muciniphila菌胞外囊泡(Extracellular vesicle,EV)可使结肠上皮细胞产生的促炎因子白细胞介素(IL)-6生成减少。说明A.Muciniphila菌胞外囊泡能有效减轻对DSS诱导结肠炎的炎性程度,从而对正常的肠道组织起到保护作用。Amuc-1100作为A.muciniphila的一种外膜蛋白,通过激活由肠上皮细胞Toll样受体2( Toll-like receptor 2,TLR2)介导的胞内信号,使得肠道黏膜屏障的保护作用增强。Amuc-1100还能诱导产生IL-10,起抗炎的作用[14]。研究显示,溃疡性结肠炎病情较严重患者中的A.muciniphila菌含量明显下降[15]。二甲双胍及一些寡聚果糖[16]、石榴鞣单宁[17]和膳食纤维[3]等可以增加肠道内A.muciniphila菌,而相关中成药对其却少有相关报道。

本研究用RT-PCR技术分析结果表明,保和丸对DSS诱导的UC模型小鼠肠道中A.muciniphila细菌有明显促进增殖的作用。由于5-氨基水杨酸是一种抗菌药,在实验中表现出了轻微的抑制作用,而本研究中模型组小鼠肠道中的少量增殖情况可能是炎症早期黏蛋白分泌增多进而促进了A.muciniphila菌的增殖。