肠道菌群代谢相关产物与6～9岁健康儿童骨骼肌质量的相关性分析

龙海旭, 詹红艳, 陆 影, 李巧香, 唐美美, 陆轶鑫

(湖南中医药大学第二附属医院儿科, 湖南 长沙 410005)

儿童正处于生长发育的最快速阶段,健康的骨骼生理有助于对抗骨骼疾病,降低成年后期骨折的风险[1]。骨骼健康与正常骨量密切相关,通常采用骨矿物质密度(Bone mineral density,BMD)评估儿童骨量[2]。BMD定义为矿物质含量与骨体积的比率(g/cm3),超过85%的峰值BMD是在18岁时积累,尤其是在青少年时期。调查显示,儿童期峰值骨量增加10%将使骨质疏松症的发病延迟13年,并使骨质疏松性骨折的风险降低50%[3]。因此,在成长过程中最大限度地保持骨骼健康可以防止衰老过程中的骨质疏松和骨折。新出现的证据表明,在包括骨质疏松症在内的多种疾病中,肠道微生物群和微生物代谢物的组成发生了改变[4]。短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)作为主要肠道菌群代谢产物,其通过调节胰岛素样生长因子或改变骨免疫状态来破坏骨形成和吸收之间的平衡,从而影响骨量变化[5-6]。然而,目前关于SCFAs对儿童骨量影响的研究有限。因此,本研究试图探索6～9岁儿童肠粪便SCFAs与骨骼肌质量的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料：在2021年12月至2023年1月期间在本院进行这项横断面研究。总共有221名6～9岁儿童的父母或法定监护人提供了使用这些数据的知情同意书。排除标准：①在粪便样本收集前3个月内使用抗生素;②双胎和早产;③一般资料不全,粪便采集不全,或骨密度检测不全。最后,共有176名具有核心数据的参与者(68名女孩和108名男孩)被纳入本研究。本研究方案经本院伦理委员会批准同意。

1.2双X射线吸收测定法(DXA)测量骨骼肌质量指标：使用Tanita MC-780A秤(日本Tanita Corporation公司)测量所有参与者的体重(精确到0.1 kg)。使用Discovery W系统(美国Hologic公司)测定全身(total body,TB)、除头部外全身骨骼(total body less head,TBLH)、腰椎(lumbar spine,LS)和骨盆(pelvic,PELV)的骨矿物质含量(bone mineral content,BMC)和骨面积(bone area,BA)值。通过将BMC除以BA计算BMD。根据文献推荐的TBLH骨密度参考值计算Z值[7]。纳入研究的儿童被分层为Z值≥0的正常BMD(n = 120)和Z值< 0的低BMD(n = 56)。此外,通过全身DXA扫描评估全身脂肪量(total body fat mass,TBF)、四肢脂肪量(appendicular fat mass,AFM)、无脂肪量和骨量。全身瘦软组织质量(total body lean soft tissue mass,TSM)计算为无脂肪质量减去骨质量(包括骨骼肌质量以及所有其他器官的质量)。四肢骨骼肌质量(Appendicular skeletal muscle mass,ASM)计算为手臂和腿部肌肉质量的总和,是全身骨骼肌质量的主要指标。

1.3SCFAs测量：参照文献方法,使用高效液相色谱(HPLC)测定粪便中的短链脂肪酸浓度[8]。色谱条件包括一台Agilent 1200 HEWLETT PACKARD(美国Agilent公司)HPLC机器;色谱柱为ZORBAX C18(250mm×6mm,美国Agilent公司);流动相由乙腈、甲醇和0.1%三氟乙酸组成(比例分别为3.3∶1.7∶94.9,在30min的时间间隔内该比率逐渐变为53.4∶28.5∶18.0,随后逐渐变回初始比率,保持该比率直到每次样品分析结束);柱温保持在50℃;流速设定为1.1mL/min。测量波长为400nm。使用特定批次的研究样本对混合粪便上清液样本进行分析,以监控分析精度,计算出日内和日间重现性的变异系数分别为2.4%～9.8%和3.9%～11.4%,SCFAs的回收率为80%～120%。

1.4解释变量收集：由调查员通过面对面访谈收集家庭收入、父母教育水平和分娩方式等数据。通过定量食物频率问卷评估过去一年的膳食摄入量,和通过2009年中国食物成分表进行计算能量和纤维的膳食消耗[9]。

1.5统计分析：使用SPSS22.0进行所有统计分析。对于描述性统计,连续变量表示为平均值±标准差,分类变量表示为频率(百分比)。通过卡方检验和t检验进行各组之间的差异分析。Spearman相关分析用于评估SCFAs与DXA骨量测量的相关性。使用多元线性回归模型检验这些相关性是否独立于潜在的协变量,包括年龄、性别、身高、分娩方式、家庭收入、父母教育、钙和多种维生素补充剂的使用、总能量和纤维的膳食摄入量用于调整。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1参与者特征：按BMD分层的参与者的特征,见表1。正常BMD组和低BMD组儿童的年龄、性别、膳食能量、纤维摄入、分娩方式、家庭收入、父母学历等指标差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

表1 受试者的基线特征

2.2参与者骨骼肌质量指标：与正常BMD组相比,低BMD组的TB BMD、TBLH BMD、LS BMD、PELV BMD、TSM/TBF、ASM/AFM均显著降低(P<0.05),和TSM、ASM均显著增加(P<0.05),见表2。

表2 参与者骨骼肌质量指标

2.3受试者的粪便SCFAs：受试者的粪便SCFAs分析结果见表3所示。与正常BMD组相比,低BMD组的粪便戊酸水平显著增加(P<0.05),和乙酸、丁酸、总SCFAs水平显著降低(P<0.05)。两组其他SCFAs指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 受试者的粪便SCFAs

2.4Spearman相关分析粪便SCFAs与骨骼肌质量的关系：如图1A所示,Spearman相关分析表明,PELV BMD与乙酸、丁酸和总SCFAs显著正相关(r=0.19、0.24、0.17,P<0.05)。粪便样本中的4-甲基戊酸与TB BMD、TBLH BMD、PELV BMD呈负相关(r=-0.25、-0.32、-0.29,P<0.01)。粪便样本中的丁酸、乙酸和总SCFAs水平与TSM、ASM呈正相关(r = 0.16～0.21,P<0.05),与TSM/TBF、ASM/AFM呈负相关(r = -0.17～-0.25,P<0.05)。校正协变量和FDR校正后,多元回归分析显示TBLH BMD、PELV BMD与丁酸、戊酸和总SCFAs显著正相关(β=0.15～0.23,P<0.05)(图1B)。

图1 粪便SCFAs与骨骼肌质量的spearman相关分析

3 讨 论

这项横断面研究检验了健康儿童粪便SCFAs和骨量测量之间的关系。在控制了潜在的协变量和多重比较校正后,研究结果显示,粪便中丁酸、戊酸和总SCFAs水平较高的儿童表现出较高TBLH BMD、PELV BMD。

SCFAs具有向远处器官扩散和诱导有效骨调节作用的能力,表明SCFAs可能作为破骨细胞代谢和骨稳态的有效调节剂。例如,丙酸盐和丁酸盐在体外以剂量和时间依赖的方式抑制骨钙素分化。一项大鼠模型研究显示,除了喂食高膳食纤维饮食外,用SCFAs治疗大鼠显著增加了骨量,并防止了绝经后和炎症诱导的骨丢失,在刚断奶大鼠中,对SCFAs产生的膳食纤维干预将促进骨量显著增加[10]。目前,较少有研究直接调查SCFAs和骨矿物质状态之间的联系。在我们的数据中,与正常BMD组相比,低BMD组的粪便戊酸水平显著增加(P<0.05),和乙酸、丁酸、总SCFAs水平显著降低(P<0.05)。直链SCFAs来源于复杂碳水化合物(如膳食纤维)的微生物发酵,而支链SCFAs(异丁酸、2-甲基丁酸、4-甲基戊酸和异戊酸)来源于支链氨基酸的代谢。然而,尚不清楚这两种类型的SCFAs是否发挥不同的生理作用。现有的证据表明SCFAs像一把“双刃剑”共同发挥作用。一方面,这些酸作为一种重要的能量来源,具有通过增强糖异生和脂肪生成来影响骨量增加的潜力,这与我们的结果一致。另一方面,据报道,短链脂肪酸有利于减肥[11]。因此,在得出准确的结论之前,需要开展更多的受控人类干预研究。

以前很少有研究调查SCFAs在肌肉质量中的作用。本研究中,TBLH BMD、PELV BMD与丁酸、戊酸和总SCFAs显著正相关。根据我们的研究结果,大多数先前的成人横断面研究都报告了骨量降低个体的粪便中乙酸、丙酸和丁酸浓度高于骨量正常个体[12-13]。与成年人的这些发现一致,Chen等[14]观察到,与肌肉质量正常的儿童相比,低肌肉质量儿童粪便中乙酸、丙酸和丁酸的浓度以及总SCFAs的浓度明显较高。Houtman等[15]观察到,乙酸、丙酸和丁酸的空腹循环浓度与全身脂肪、内脏脂肪和皮下脂肪的百分比呈正相关。在小鼠模型中,与未补充丁酸盐的对照组相比,在喂食丁酸盐10个月的老龄小鼠中观察到肌肉质量/体重比增加。类似地,Lahiri等[16]观察到骨骼肌萎缩的小鼠粪便中乙酸、丙酸和丁酸水平较未发生萎缩的小鼠降低。现有证据主要涉及乙酸、丙酸和丁酸,这些酸是一种重要的能量来源,有可能通过增强糖异生和脂肪生成来影响体脂。尚不清楚肠道微生物群/SCFAs是否可以通过沉积体脂来调节肌肉质量。

这项研究在儿童粪便样本中探索了SCFAs与骨量的关系。然而,一些限制也值得考虑。①本研究横截面数据的性质无法进行因果推断。对于SCFAs与骨量联系的潜在机制需要在体外和体内的进一步研究中探索。②本研究没有对骨质疏松性骨折最常发生的髋部进行DXA检查,但是从之前研究中获得的数据表明,TB、LS和股骨颈的BMD之间有很强的相关性[17]。③本研究没有对SCFAs数据进行跟踪分析,未来的研究应该随着时间的推移收集研究人群的粪便样本,以评估纵向变化。④本研究没有测量血液中的SCFAs浓度,这可能更好地代表SCFAs吸收。

总之,这项针对6～9岁健康儿童的研究结果表明,粪便丁酸、戊酸和总SCFAs与BMD呈正相关。未来的纵向研究将重复评估SCFAs的其他代谢标记(盲肠、血液、遗传部分代谢物等)来验证我们的发现。