Periostin表达在乳恒牙替换中的临床意义

张勇 张洪兰 秦晗

[摘要] 目的 探討Periostin在替牙期对骨改建和自噬的影响，研究Periostin在乳恒牙替换过程中调节骨代谢平衡的作用机制。方法 收集笔者所在医院因乳牙根尖周病及多生牙拔除的牙根周围粘连牙槽骨，体外培养成骨细胞，分为实验组和对照组各15例，实验组培养基中加Periostin，原位杂交法检测标本中Periostin、骨代谢基因、自噬基因的mRNA水平。蛋白质印记法检测成骨细胞中骨代谢蛋白，自噬蛋白表达。结果 原位杂交结果显示，实验组Periostin表达低于对照组（P<0.05），核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κb ligand，RANKL）、LC3、BECN1表达及RANKL/骨保护素（osteoprotegerin，OPG）值高于对照组（均P<0.05），OPG表达差异无统计学意义（P>0.05）；蛋白质印迹法显示实验组RANKL、RANKL/OPG、LC3Ⅱ、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ与对照组比较水平低（均P<0.05），OPG、LC3Ⅰ较对照组差异无统计学意义（均P>0.05）。结论 Periostin通过降低RANKL表达及改善过强自噬状态，从而减少炎症所致的骨吸收。

[关键词] 骨膜蛋白；骨改建；乳恒牙替换；自噬

[中图分类号] R788    [文献标识码] A     [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.02.001

Clinical significance of Periostin expression in the replacement of primary permanent teeth

ZHANG Yong1， ZHANG Honglan2， QIN Han1

1.Department of Stomatology， Lianyungang Clinical Medical College Nanjing Medical University， Lianyungang 222000， Jiangsu， China; 2.Department of Pathology， Lianyungang Clinical Medical College Nanjing Medical University， Lianyungang 222000， Jiangsu， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of periostin on bone remodeling and autophagy during the period of tooth replacement and to investigate the mechanism of action of periostin in regulating the balance of bone metabolism during the replacement of primary and permanent teeth. Methods Fifteen cases each of experimental and control groups were collected from the periapical periodontal disease and multiple teeth extracted for periapical adhesions in the author’s hospital， the mRNA levels of periostin， bone metabolism genes， and autophagy genes were detected in the specimens by in situ hybridization. Osteoblasts were cultured in vitro， periostin was added to the culture medium of the experimental group， and the expression of bone metabolism proteins [receptor activator of nuclear factor-κb ligand （RANKL）， osteoprotegerin （OPG）] and autophagy proteins （LC3， Beclin-1） in osteoblasts was detected by Western blot. Results In situ hybridization results showed that periostin expression in the experimental group was lower than that in the control group （P<0.05）， RANKL， LC3， BECN1 expression and RANKL/OPG values were higher than those in the control group （all P<0.05）， and no significant differences were seen in OPG expression （P>0.05）; protein blotting showed that RANKL， RANKL/OPG， LC3Ⅱ， Beclin-1， LC3Ⅱ/LC3Ⅰ were lower in the experimental group than in the control group （all P<0.05）， and no significant differences were seen in OPG and LC3Ⅰ than in the control group （P>0.05）. Conclusion Periostin reduces inflammation-induced bone resorption by reducing RANKL expression and improving hyperautophagic state.

[Key words] Periostin; Bone remodeling; Tooth replacement; Autophagy

骨膜蛋白（Periostin）是一种细胞外基質（extracellular matrix，ECM）蛋白，最初即是发现于成骨细胞当中，在骨重塑的过程中，Periostin表达水平升高并具有维持正常骨改建的作用[1-2]。乳恒牙替换是骨改建十分活跃的生理活动，乳牙根尖周炎会导致骨吸收增强，骨形成减弱[3]。由成骨细胞等细胞分泌产生的核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κb ligand，RANKL）能够与核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANK）结合激活破骨细胞，骨保护素（osteoprotegerin，OPG）和RANK竞争与RANKL结合减弱破骨细胞活性，因此RANKL、OPG的相对水平可以反应骨吸收的活跃程度，即RANKL/OPG比值高时，骨吸收活跃，反之，则骨吸收受抑制[4-7]。乳恒牙替换异常的一项重要原因是根尖周炎症导致的过强骨吸收[8]。

炎症与自噬之间关系密切，自噬被视为机体的一种防御功能，它具有清除受损细胞器和感染病原体的能力，同时自噬能够修饰病原体，使其病原体能够稳定的存在于宿主体内，这表明自噬与炎症之间存在双向调节作用，维持组织平衡[9-12]。Izuhara等[13]研究结果表明，感染性炎症加重时，Periostin表达水平降低。微管相关蛋白1轻链3（microtubule associated protein 1 light chain，LC3）和Beclin-1是被广为认可的自噬标志物，其中LC3基因编码的蛋白随自噬活动变化分为LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，其中LC3Ⅱ/LCI的比值反映了自噬强度，该值越高，自噬越强，反之，自噬越弱，Beclin-1是由BECN1基因编码的蛋白质，上调Beclin-1会增强自噬水平[14-18]。本研究通过检测临床标本和细胞中不同Periostin水平下骨代谢和自噬强度的影响，初步探讨Periostin在乳恒牙替换过程中调节骨代谢平衡的机制。

1  材料与方法

1.1  主要材料

牙槽骨标本（南京医科大学连云港临床医学院）、原位杂交试剂盒（武汉博士德生物科技有限公司）、DAB染色剂（北京中杉金桥生物科技有限公司）、小鼠成骨细胞系（中国科学院上海细胞库）、胎牛血清（上海威正翔生物科技有限公司）、BCA蛋白检测试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）、蛋白质预染标志物（上海赛默飞世尔有限公司）、ECL-PLUS试剂盒（上海赛默飞世尔有限公司）、SDS-PAGE蛋白电泳仪（上海天能科技有限公司）、蛋白转能仪（上海天能科技有限公司）、离心机（上海赛默飞世尔有限公司）、倒置显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）、生物安全柜（上海振祥创科技有限公司）、CO2培养箱（日本三洋贸易株式会社）。本研究经过连云港市第一人民医院医学伦理委员会审查（伦理审批号KY-20220224003）。

1.2  原位杂交临床标本

收集所在医院2021年9月至2022年6月重度乳牙根尖周病拔除的滞留乳牙为标本，甲酸脱钙4周，制备成组织切片，使用多聚赖氨酸处理过的载玻片，脱蜡至水，30%过氧化氢灭活内源性酶，胃蛋白酶暴露核酸片段，4%多聚甲醛后固定标本，按原位杂交试剂盒进行组织化学染色，依次进行与预杂交、杂交，分别加入封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化过氧化物酶，DAB镜下控制染色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察Periostin、核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κb ligand，RANKL）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、BECN1、LC3的mRNA表达，使用Image J量化分析表达。

1.3  成骨细胞培养与分组

取出购置的成骨细胞系，在37℃ 5%CO2的培养箱中分实验组（n=15，a-MEM培养基）和对照组（n=15，a-MEM培养基）进行，每3d传代1次，取处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化成细胞悬液，接种至培养板上，观察细胞生长情况，体外培养的成骨细胞贴壁生长，分布均匀，形态多样，丰富的胞质向外生长出生长突，细胞核清晰，呈圆形或卵圆形。

1.4  Western blot法检测成骨细胞中的RANKL、OPG、Beclin-1、LC3蛋白表达

在进行WB实验取样前3d换液，并在实验组培养基中加入浓度为75ng/μl的Periostin。收集成骨细胞，预冷PBS洗涤培养细胞，细胞裂解液充分裂解细胞，4℃ 12 000r/min 15min离心，取上清于新离心管中，蛋白定量，根据RANKL、OPG、Beclin-1、LC3蛋白大小配置不同的浓度的SDS-PAGE胶，使用十二烷基硫酸钠聚丙烯胺凝胶法电泳，电泳完成后在4℃ 100V的条件下2h，将蛋白转移至PVDF膜上。取出PVDF膜，4℃过夜。加入第一抗体Beclin-1（1∶300）、LC3（1∶300）、OPG（1∶100）、RANKL（1∶85），4℃过夜。孵育完成后，PBS洗涤PVDF膜3次，分别加入第二抗体兔抗，其中RANKL为鼠抗IgG（1∶2000），室温孵育1h，PBS洗涤3次，X线曝光、显影、定影，结果分析。内参选用GAPDH（小鼠，上海Santa Cruz生物技术有限公司，1∶2000，36kDa）。

1.5  统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件对数据进行处理分析，计量数据均数±标准差（）表示，實验组和对照组进行t检验，以P<0.05差异有统计学意义。

2  结果

2.1  临床标本原位杂交结果分析

滞留乳牙根尖周炎组织中Periostin的表达水平明显低于正常牙槽骨组织（0.18±0.01 vs. 0.26±0.04，P<0.05）；正常牙槽骨组织中RANKL、RANKL/OPG、LC3、BECN1均显著低于滞留乳牙根尖周炎组织（0.16±0.01 vs. 0.23±0.02，P<0.05；0.84±0.16 vs. 1.35±0.07，P<0.05；0.21±0.02 vs. 0.30±0.03，P<0.05；0.16±0.03 vs. 0.31±0.04，P<0.05）；滞留乳牙根尖周病组织和正常牙槽骨组织中OPG的表达水平差异无统计学意义（0.17±0.03 vs. 0.19±0.01，P>0.05）。见表1，图1。

2.2  Western blot法检测体外培养的成骨细胞结果分析

体外培养的成骨细胞贴壁生长，分布均匀，形态多样，丰富的胞质向外生长出生长突，细胞核清晰，呈圆形或卵圆形。见图2。

培养基中含Periostin的实验组RANKL、RANKL/OPG、Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均较对照组表达水平低（0.57±0.03 vs. 0.72±0.05，P<0.05；0.56±0.01 vs. 0.64±0.04，P<0.05；0.89±0.11 vs. 1.28±0.20，P<0.05；0.96±0.04 vs. 1.26±0.05，P<0.05，0.86±0.06 vs. 1.19±0.09，P<0.05）。两组OPG、LC3Ⅰ比较差异无统计学意义（1.02±0.12 vs. 1.12±0.10，P>0.05；1.20±0.10 vs. 1.06±0.09，P>0.05），Periostin

能够降低RANKL、RANKL/OPG和自噬水平，见表2，图3。

3  讨论

乳恒牙替换过程需要骨吸收与骨形成的相互作用，部分乳牙根尖周炎会引起牙根根尖及周围牙槽骨病变吸收，而由于炎症的作用，骨形成未能正常进行，部分患者就会出现牙齿替换异常，严重影响了牙列完整和健康，同时研究发现牙齿萌出和成骨细胞分化的过程中，Periostin表达是明显增加的[19-21]。但Periostin如何调节乳恒牙替换的具体机制仍不明确。

在乳恒牙替换时，乳牙根及其与恒牙胚之间的牙槽骨吸收形成萌出通道，同时，随着恒牙胚的生长发育，恒牙牙根逐渐形成，并在牙胚周围及根方形成新的牙槽骨[22-23]。RANKL/OPG的比值反映了骨吸收的活跃程度，因此在乳恒牙替换过程中，RANKL/OPG的比值维持在一个合理的区间，才能使替牙期间骨改建的正常进行。在本研究显示，根尖周炎标本中的RANKL/OPG的比值明显高于对照组，而Periostin表达却低于对照组，另一部分细胞实验显示，含Periostin培养基培养的成骨细胞中，RANKL/OPG的比值明显低于对照组，二者均表明Periostin的表达水平与RANKL/OPG时负相关的。由此推测，Periostin对根尖周炎所致的骨吸收可能有一定的抑制作用。

自噬与炎症之间存在密切联系，细胞自噬既能够通过自身生理活动清除入侵的病原体，也会因为过强的细胞自噬消耗过多的自噬转运蛋白而减弱线粒体自噬，从而引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累，激活炎症小体[24-25]。在本研究中，病原体入侵引起根尖周组织的炎症，LC3和BECN1的mRNA表达水平证实了炎症标本中较强的细胞自噬，对照组中Periostin表达高于实验组，另一部分细胞实验显示，培养基中含Periostin的成骨细胞中的Beclin-1水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，表明Periostin表达水平与自噬是负相关的，提示Periostin可能可以通过调节细胞自噬，主要是以降低过强自噬使其达到一个相对正常的水平来降低炎症对于骨吸收的损害状况，从而保障成骨细胞的正常功能，达到乳恒牙正常替换的目的。

Periostin如今已经被广泛用于骨组织损伤的治疗中，它能够加速损伤愈合，加快骨代谢的速度，Periostin对于组织损伤修复的作用有一部分是通过降低或者抑制损伤区域的炎症反应实现的[26-27]。此外，研究表明Periostin的过表达能够上调骨形成速率和骨量，提示Periostin既能够抑制骨吸收，也能促进骨形成[28]。

综上，Periostin一方面可能通过抑制由于炎症导致的过多RANKL的产生，使RANKL/OPG比值减小，使骨吸收活动减弱；另一方面，Periostin可以调低过强的细胞自噬活动来改善严重的乳牙根尖周炎环境，从而减少因炎症导致的骨吸收过多。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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