基于多指标综合评价法优化通脑康方传统制备工艺研究*

付 蓉 王万林 董细姿 程金生 董历华

补阳还五汤是清代名医王清任《医林改错·瘫痿论》中的经典名方,由黄芪、当归、赤芍、地龙、红花、川芎、桃仁7味药物组成,具有补气活血,祛瘀通络之功效[1],临床主治气虚血瘀所致的中风,症见半身不遂、口眼歪斜、言语謇涩等[2]。现代研究表明,其药理学作用涉及促进血管神经再生,抑制血小板因子活性、抗纤维化及降低炎症因子含量等[3],在治疗脑卒中方面具有保护神经功能,改善脑损伤及抗自由基氧化的作用[4]。而乐平市中医医院王万林主任中医师经过多年大量的临床运用发现,将补阳还五汤加减化裁成通脑康方在用于缺血性脑卒中的疗效上优于补阳还五汤,且不良反应发生率低,更符合当今中风患者痰瘀夹杂的证型特点。全方共由黄芪、水蛭、法半夏、茯苓等10味中药组成,具有益气除湿、活血通络的功效,用于中风之气虚痰瘀互阻证。

通脑康原方往往入煎剂或以饮片全粉制备水泛丸应用,存在口服用量大、贮存携带不便且患者依从性低等缺点。考虑到中风患者自理能力和吞咽功能均有不同程度的下降,而颗粒剂具有液体制剂和固体制剂的双重功效,既能保留中医方剂配伍特点,又能克服汤剂及丸剂服用不便[5]。因此,将其改良制成颗粒剂是一种较好的选择,符合临床用药需求。

中药制剂作为中医药的重要组成部分,既能发挥中医药原创优势,又能丰富治疗疾病的医学手段,还能为探索中药新药开发提高价值途径[6]。自国家食品药品监督管理局发布《关于对医疗机构应用传统工艺配制中药制剂实施备案管理的公告》[7]以来,传统工艺制备中药制剂是研究开发院内制剂的主要途径[8]。因此,课题组在原有汤剂的基础上以黄芪主要成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷[9],桃仁主要成分苦杏仁苷[10]及得膏率为主要考察指标进行综合评价,以加水量、提取时间及提取次数作为主要影响因素,进行正交试验对通脑康颗粒的传统制备工艺筛选优化,以期为今后通脑康颗粒的注册备案与其相关制剂的研究开发提供参考。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦),PWN225DZH电子天平(常州奥豪斯),电热鼓风干燥箱(天津泰斯特),多功能粉碎机(武义海纳电器),JP-030超声波清洗器(深圳洁盟)。

1.2 材料

1.2.1 药材通脑康方所用10味中药饮片包括黄芪(批号210401)、当归(批号210801)、川芎(批号200501)、桃仁(批号210901)、红花(批号220601)、地龙(批号220701)、蕲蛇(批号210401)、水蛭(批号220701)、茯苓(批号221001)及法半夏(批号220702),均购自安徽亳州千草制药股份有限公司,经乐平市中医医院程金生副主任中药师鉴定均为正品,可做药用,其中水蛭粉碎后过六号筛备用,其他药材均入煎剂。

1.2.2 试剂毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号111920-201907,含量96.8%),苦杏仁苷对照品(批号110802-202109,含量93.1%)均购自中国食品药品检定研究院,辅料糊精为药用级,乙腈、甲醇为色谱纯,其他试剂试药均为分析纯,分析用水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 对照品溶液制备取毛蕊异黄酮葡萄糖苷和苦杏仁苷对照品适量,精密称定,加入70%甲醇定容,制成质量浓度分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷20 μg/ml,苦杏仁苷 80 μg/ml的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备精密称定水提干膏粉5 g置于50 ml具塞锥形瓶中,加入甲醇定容,超声处理30 min(功率180 W,频率40 kHz),放冷,再称定重量,用甲醇补足减少的重量,摇匀后过滤,取滤液即得供试品溶液。

2.1.3 阴性供试品溶液制备按处方比例制备不含黄芪和苦杏仁的阴性样品,再按“2.1.2”项下的溶液制备方法制备成缺少黄芪和苦杏仁的阴性对照品溶液。

2.1.4 色谱条件和专属性色谱柱为Agilent 1260 ODS柱(4.6×250 mm,5 μm),以乙腈为流动相A,0.1%磷酸溶液为流动相B,按流动相A 0～10 min,0→15%;10～20 min,15%→20%;20～40 min,20%→40%的浓度梯度洗脱,检测波长为230 nm,柱温30 ℃,进样量10 μl,理论塔板数均不低于4000,色谱图见图1～图3。

注:a苦杏仁苷;b毛蕊异黄酮葡萄糖苷。图1 混合对照品溶液

注:a苦杏仁苷;b毛蕊异黄酮葡萄糖苷。图2 供试品溶液

图3 缺黄芪 苦杏仁阴性供试品溶液

2.1.5 线性关系精密吸取6个不同浓度的混合对照品溶液,按照“2.1.3”项下色谱条件进行测定,结果以对照品进样浓度为横坐标X,以峰面积为纵坐标Y,绘制标准曲线,进行线性回归,毛蕊异黄酮葡萄糖苷的回归方程为Y=30.772X-1.538,r=0.9991,苦杏仁苷的回归方程为Y=1394.279X-5542.700,r=0.9996,说明毛蕊异黄酮葡萄糖苷在2.155～25.857 μg和苦杏仁苷在33.933～407.195 μg具备良好线性关系。

2.1.6 精密度实验取“2.1.1”项下的对照品混合溶液,在“2.1.4”色谱条件下重复进样6次,测定峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的RSD分别为0.34%和0.24%,表明仪器的精密度良好。

2.1.7 稳定性实验取同一批供试品溶液,在“2.1.4”色谱条件下,分别在0、3、6、9、12、15、18、24 h进样测定峰面积。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、苦杏仁苷的RSD分别1.99%和0.76%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8 重复性实验精密称取同一批水提干膏粉6份,按照“2.1.2”制备供试品溶液,在“2.1.4”色谱条件下测定峰面积并计算各成分含量。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的RSD分别为1.76%和1.22%,表明该实验重复性良好。

2.1.9 加样回收率精密称取水提干膏粉5 g,平行6份,分别加入一定量“2.1.1”下的混合对照品溶液,按照“2.1.2”制备供试品溶液,在“2.1.4”色谱条件下测定峰面积及加样回收率。结果显示毛蕊异黄酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的RSD分别为3.41%和1.72%,平均加样回收率分别为100.05%和104.42%,实验方法准确度良好。

2.2 提取工艺研究

2.2.1 吸水率课题组取通脑康方中入煎剂药材五分之一的量,置于烧杯中加纯化水分别记录0.5、1、2、4、6 h的增重情况考察吸水率,结果该药材在4 h后无明显吸水,药材的吸水率为161%。

2.2.2 正交试验本方制剂是利用传统工艺制备,因此只能选择传统水提工艺,以毛蕊异黄酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的含量为评价指标,正交试验考察加水量、提取时间及提取次数的影响,三因素三水平见表1。

表1 提取工艺因素水平

2.2.3 提取工艺称取二分之一处方量药材(除水蛭),按设定方案进行煎煮,过滤,浓缩至100 ml,得到9个水提液。精密量取水提液2 ml,按“2.1.2”方法制备供试品溶液,以毛蕊异黄酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的含量和得膏率为综合评价指标,优选出最佳提取工艺。见表2。根据R值可看出,各因素对含量影响大小为C>A>B,由K值大小,可判断最佳工艺条件为A3B2C3,考虑到药材的吸水率为161%,第2次和第3次加水量可适当减少。因此,优选提取工艺为:煎煮3次,第1次加12倍水煎煮1.5 h,第2次加10倍量水煎煮1.5 h,第3次加10倍量水煎煮1.5 h。

表2 正交试验L9(34)结果 (例,%)

得膏率测定:精密量取水提液20 ml,置已干燥至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷却0.5 h,迅速称重,以干燥品计算供试品中浸出物的含量。浸膏得率(%)=浸膏重量/20 ml药液相当于药材重量×100%。

综合评价法:根据处方中的君臣佐使所起的作用权衡分配不同的比例,综合评分(%)=毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量/组内最高值×40%+苦杏仁苷含量/组内最高值×30%+得膏率/组内最高值×30%×100%。

2.2.4 工艺验证按处方量称取饮片3份(除水蛭),按上述正交优选工艺进行提取,浓缩至100 ml,得到3份水提液,分别取水提液测定主要成分含量及浸膏得率。见表3。经过3批工艺验证,毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量在0.2 mg/g左右,苦杏仁苷在1.6 mg/g左右,得膏率在28%～30%,综合评分96.33%,表明该优选工艺稳定可行,可进一步扩大工业化生产。

表3 提取工艺验证 (例,%)

2.3 成型工艺研究

2.3.1 样品制备取20倍处方量称取药材,其中水蛭打粉过六号筛,其余药材按上述最佳提取工艺制备至稠膏,减压干燥后粉碎成细粉,最后将两者混合备用。

2.3.2 流动性课题组采取固定漏斗法测量混合干膏粉休止角,平行测量3次,休止角的平均值为42.76°,流动性较差,不能直接制粒,因此还需要加入一定量的辅料。

2.3.3 润湿剂浓度课题组前期通过以75%、85%、95%乙醇进行润湿剂考察实验,发现75%乙醇制软材起团,容易黏附筛孔,而95%乙醇会使软材粘性差,细粉较多,因此本实验采用85%乙醇做润湿剂。

2.3.4 辅料比例颗粒剂传统辅料中常见的有糊精、蔗糖等,由于在临床实践中,蔗糖对合并糖尿病患者的血糖影响较大,而糊精的市场价格最为实惠,在颗粒制剂中应用非常安全广泛[11]。因此,课题组选择全部采用糊精作为颗粒剂辅料并进行药辅比例考察。将干膏粉与一定量糊精混匀,制粒,以制粒难易程度、休止角、24 h吸湿率及成型率对糊精的用量进行优选,综合评价法=(成型率/组内最高值×40%+组内最小值/休止角×30%+组内最小值/吸湿率×30%)×100%。见表4。根据实验结果,最终确定最佳的药辅比例为1∶1.2,考虑到生产批量不同,实际生产中可适当微调。

表4 辅料用量选择 (例,%)

2.3.5 干燥条件为防止干燥过程对颗粒造成影响,因此选用真空干燥箱进行干燥,在70 ℃条件下干燥至水分6%,考虑到生产批量不同,可适当微调。

2.3.6 工艺验证以上述优选成型工艺制备3批通脑康颗粒,进行工艺验证实验。结果显示3次实验综合评分平均为97.85%,与考察实验99.01%接近,证明该实验方法稳定可行。见表5。

表5 成型工艺验证 (例,%)

3 讨论

通脑康方由经典方剂补阳还五汤裁化而来,方中黄芪补气行血为君药,当归活血补血为臣药,桃仁、红花、川芎、水蛭、地龙、蕲蛇活血化瘀,通经活络为佐药,半夏、茯苓祛痰除湿亦为佐药,全方中药合用共奏补气除湿、活血通络之效,用于气虚痰瘀互阻型中风。

该方以汤剂形式在东平市中医医院临床应用多年,其中水蛭打粉以汤剂冲服,且有多项研究表明水蛭以散剂服用的抗凝血及抗血栓作用均优于煎剂[12-14],因此,课题组在制备工艺上仍然选择采用水蛭单独粉碎后再与其他药材干膏粉混合制备颗粒剂,最大程度上保持与原方一致。

课题组前期参考2020版《中华人民共和国药典》[15]及相关文献[16-18],考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸及甲醇-0.1%磷酸4种流动相下毛蕊异黄酮葡萄糖苷和苦杏仁苷的色谱峰分离情况,发现乙腈-0.1%磷酸杂峰较少,故最终定为实验流动相。同时根据混合对照品全波长扫描结果,毛蕊异黄酮葡萄糖苷及苦杏仁苷在230 nm处均吸收较大且分离度好,定为实验检测波长。制备工艺优化过程中,虽然正交试验及综合评分显示加水12倍,提取3次,每次提取1.5 h为最佳工艺,但是实际上考虑到药材的吸水率,第2次和第3次加水量可以适当减少,另外成型工艺中包括润湿剂的浓度以及辅料的用量,考虑到生产批次的不同也可以根据实际质量检测情况进行微调。

本研究采用正交试验结合多指标评价法,将两类主要功效药味中的有效成分与得膏率,休止角、成型率与制粒情况等综合考察工艺参数,相比单一成分及其指标更能有效地进行制剂质量控制。通过以上论述,本实验优选的制备工艺稳定可行,可以为后期通脑康颗粒注册备案及其相关的中药制剂研究开发提供依据。