不同种源红锥叶片表型变异分析

李 娜，杨袁木，李子玥,3，魏瑞研，徐 放，陈新宇，朱报著，张卫华*

(1.广东省林业科学研究院 / 广东省森林培育与保护利用重点实验室，广东 广州 510520；2.广东省森林资源保育中心，广东 广州510173；3.河北农业大学林学院，河北 保定 071000)

红锥Castanopsishystrix又名红黎、赤黎、锥栗、刺栲、红栲等，隶属壳斗科的常绿阔叶乔木，分布于我国广东、广西及福建等省(自治区)。该树种适应性强，生长较快，树干通直、材质优良，生态和经济效益显著，是华南地区珍贵乡土用材和高效多用途速生树种。其木材坚硬耐腐蚀，少变形，易加工，心材大、褐红色，边材淡红色，色泽和纹理美观，是优质用材树种；果实富含淀粉，可炒食，也可用来酿酒、做饲料；种实、壳斗均富含单宁，可提制栲胶用于工业生产；枝叶茂密，耐荫性好，枝条萌芽力强，生长迅速。混生性能强，可作为用材林进行纯林种植，亦可与桉树等混交造林[1—4]，是构建木材储备林和生态公益林的重要乡土树种，是广东省重点发展的优质用材树种。目前，对红锥的研究主要集中在群落特征[5—6]、优良种源及优树选择[7—11]、木材材性[12—14]、叶片养分含量分析[15—17]等方面，而涉及不同种源的叶片形态变异研究相对较少。

表型性状差异常广泛用于鉴定种质资源、分析林木表型多样性和选择育种材料等，探究表型变异规律，可为新品种选择、遗传改良和引种驯化奠定基础。叶片表型变异是由植物遗传变异和环境差异共同引起的，表型差异可反映基因型变异丰富度。一般来说，种源表型变异越大，遗传变异也越大[18—20]。植物叶片易受环境影响，叶片形态与植物生理等密切相关。叶片大小和叶柄长度等表型是植物长期适应环境的结果，可利用叶片表型多样性来揭示植物生存、适应和进化规律[21]。叶面积大小直接影响着树木的生长，可作为早期指标选育林木良种[22—23]。植物叶片性状主要受自身遗传特性控制，故认为相对稳定，但受生境条件和气候特性等综合环境影响也表现出差异性，体现出对环境因子变化的适应性，常作为品种间、种源间及家系间的重要研究性状[24]。研究不同种源叶片的性状变化规律有助于解析物种的生态适应性机制[25—26]，为林木优良种源的选择提供依据。

本研究以来自17 个地理种源的229 个红锥无性系为研究对象，对其叶片表型性状进行测定和统计，利用方差分析、相关性分析和聚类分析等方法对其叶片变异规律展开研究，了解红锥不同种源叶片变异程度，探明叶片表型与种源地地理气候因子的相关关系，为其种质资源收集、保存、评价及其良种选育和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于广东省广州市白云区帽峰山，23°10'～23°18'N，113°21'～113°27'E，平均海拔534.9 m。气候为典型的南亚热带季风海洋气候，年均温21.8 ℃，其中，夏季平均温度最高为29.6 ℃，冬季平均温度最低为13 ℃。年均降水量1760 mm。母岩为花岗岩和砂岩，土壤类型属红壤，pH 为4.75～5.20，透水性良好，适宜红锥等乡土阔叶树种生长发育[27]。

1.2 材料

选自帽峰山红锥种质基因库中17 个种源229个无性系。各种源原产地经纬度及气候特征情况见表1。2001年采集当年生枝条嫁接，成活后于2003年春季定植于基因库中。2018年夏，选取不同种源每个无性系3 株长势正常、无病虫害的植株，在据东、南、西、北四个方向取植株外围中部及上部枝条从梢端数第6～8 片成龄叶，每株取8 片叶，带回实验室测定相关指标。用Matlab 软件编写命令测量叶长(Leaf length，LL)、叶宽(Leaf width，LW)、叶柄长(Petiole length，PL)、叶面积(Leaf area，LA)等参数，并计算叶形指数(Leaf index，LI，叶长/叶宽)。

表1 红锥各种源地理气候信息Table 1 Geographic information of Castanopsis hystrix populations

1.3 数据处理与统计分析

利用Excel 2019 整理原始数据，R4.2.0 软件进行统计分析。计算各种源不同性状的平均值(Mean)、标准差(SD)和变异系数(CV)，CV=SD/X×100%；利用R 软件的“corrplot”包进行相关性分析。利用SPSS 软件以欧氏距离计算种源间遗传距离，采用系统聚类法作聚类分析。

采用巢式方差分析，线性模型为：Yijk=μ+Pi+Cj/i+eijk，式中Yijk为第i 个种源内第j 个无性系第k 片叶片的观测值；μ 为总体平均值；Pi为第i 个种源效应值(随机)；Cj/i为第i 个种源内第j 个无性系效应值(随机)；eijk为剩余项[28]。采用Duncan 多重比较法分析种源间的性状差异显著性。计算种源重复力和表型分化系数，种源重复力Rp=1-1/F，F为方差分析中种源间的F值。表型分化系数Vst=σ2t/s/(σ2t/s+σ2s)，σ2t/s为种源间方差分量，σ2s为种源内的方差分量[29]。

2 结果与分析

2.1 种源间和种源内叶片性状变异分析

红锥17 个种源5 个叶片表型性状差异显著，叶面积、叶长、叶宽、叶形指数和叶柄长分别为10.9～17.9 cm2、7.5～9.3 cm、2.2～2.9 cm、3.3～3.6 和0.39～0.67 cm，均值分别为13.58 cm2、8.40 cm、2.46 cm、3.45 和0.53 cm；各性状变异系数为3.2%～15.6%，其中，变异系数最小的是叶形指数，变异系数最大的是叶柄长。

在红锥17 个种源中，云南景洪种源(P16)的叶长(9.3 cm)、叶宽(2.9 cm)和叶面积(17.9 cm2)总体上显著大于其他种源(P＜0.05)，整体表现为叶片较大、生长优势显著。广东信宜种源(P6)的叶长、叶宽和叶面积最小，分别为7.5 cm、2.2 cm 和10.9 cm2，叶形指数值处于中等水平；广东始兴种源(P9)的叶形指数值最小(3.3)，广东陆河种源(P8)的叶形指数最大(3.6)。湖南江华种源(P13)的叶柄最短(0.39 cm)，云南思茅种源(P17)的叶柄最长(0.67 cm)。方差分析表明，红锥叶片性状在种源间和种源内的差异均具有极显著差异，说明红锥叶片形态在种源间和种源内变异广泛(表2、表3)。

表3 红锥叶片表型性状方差分析Table 3 Analysis of variance of leaf phenotypic traits in Castanopsis hystrix

2.2 叶片表型性状的方差分量和表型分化系数

根据方差分量，进一步得出各性状方差分量百分比(表4)。种源间的方差分量占总变异的11.423%，种源内的占48.404%，环境随机误差占40.173%，种源内的方差分量百分比明显大于种源间；另外，从叶片5 个表型性状的种源间表型分化系数看，种源间表型分化系数变幅为1.90%～20.95%，叶面积的种源间表型分化系数最大，为20.95%，叶形指数的种源间表型分化系数最小，仅为1.90%；各表型性状的种源间平均表型分化系数为12.62%，即有87.38%的红锥叶片性状是由种源内变异引起的，故种源内变异是导致红锥叶片表型性状变异的主要来源。

表4 红锥叶片性状方差分量及种源间表型分化系数Table 4 Variance components of leaf traits and phenotypic differentiation coefficients among populations of Castanopsis hystrix

由表4 可知，各性状重复力在0.523～0.678 之间，均大于0.5，说明红锥叶片表型性状受中等以上的遗传控制。其中叶长、叶宽和叶形指数的变异系数均小于10%，这三个性状相对较稳定，受遗传因素的影响更大；叶柄长的变异系数最大，为15.6%，重复力最高，为0.678，说明叶柄长变异大，更有助于优良种源的选择。

2.3 红锥各种源叶片性状间相关性分析

各种源叶面积、叶长和叶宽3 个性状两两间呈极显著正相关，相关系数分别为0.917、0.961、0.834；而叶宽、叶面积、叶柄长分别与叶形指数呈极显著或显著负相关，相关系数分别为–0.755、–0.588、–0.529，说明叶片窄的其叶柄较短，叶形指数较大(表5)。

表5 红锥叶片表型性状间及其与地理因子的相关性分析Table 5 Correlation analysis between leaf phenotypic traits and geographical factors in Castanopsis hystrix

叶面积、叶长和叶宽与经度存在显著或极显著的负相关，相关系数分别为–0.636、–0.567、–0.496，说明越靠近东部红锥叶片越小；叶面积、叶长和叶宽与海拔呈现显著的正相关关系，相关系数分别为0.729、0.624、0.647，说明海拔高的种源在此基因库中叶片更为宽大。叶片性状只与经度和海拔有显著相关性(越靠东部叶片越短小，海拔越高的种源，其叶片越宽大)，但与原产地的纬度、年均温以及年降水量均无相关性，可见红锥的生长变异主要属随机变异模式。

2.4 聚类分析

基于红锥17 个自然种源的5 个叶片性状进行聚类分析。由图2 可知，以欧式距离15，可将17 个种源分为3 类。第1 类种源数量最多，包括广西浦北(P1)、广西博白(P2)、广西容县(P3)、广西凭祥(P4)、广东高州(P7)、广东陆河(P8)、福建金山(P10)、福建华丰(P11)、湖南江华(P13)、海南乐东(P14)、海南昌江(P15)等 11 个种源，这类种源叶片形状较小；第2类包括广西东兰(P5)、广东信宜(P6)、广东始兴(P9)、福建高车(P12)等4 个种源，这类种源叶片形状较大。第3 类种源数量最少，仅包括云南景洪(P16)和云南思茅(P17)等 2 个种源，这类种源叶片形状较大，主要为云南种源。部分地理分布相近的种源聚为1 类，如广东陆河、福建金山、福建华丰和湖南江华；但是也有部分地理分布相差很远的种源聚在一起，如广西东兰和福建高车。综合来看，红锥种源叶片特征并没有完全依照地理距离而聚类，说明红锥叶片表型性状变异存在不连续性，总体上表现出纬度变化规律。

图1 不同种源红锥叶片表型性状聚类分析Fig.1 Dendrogram of leaf phenotypic traits of Castanopsis hystrix from different provenances

3 结论与讨论

3.1 红锥叶片表型性状变异来源

林木遗传变异是选择育种的基础，因生长环境的不同，在经过长期的自然选择后会形成不同程度的变异，而且同一树种在不同种源间、同一种源内、不同个体间及个体内均存在不同程度的遗传变异[30]。植物表型性状变异对于研究植物的环境适应性和演化具有重要意义[31]，广泛用于揭示植物自然种源的遗传变异规律及地理分布格局[32—33]。在植物表型性状中，叶片性状与植物的营养、生理以及生态因子等密切相关，叶片表型性状存在较大变异，表示遗传变异丰富，这种显著性差异一方面来自自身遗传物质，另一方面可能受环境因素的影响。本研究选取的17 个种源涵盖红锥的主要地理分布范围，能较全面反映叶片表型性状的变异程度。2011年张凤良等[27]从形态学水平上对17 个红锥种源214 个优树无性系的15 个叶片表型指标进行研究，经过8年时间，又对此资源圃的表型进行测量，选取了其中5 个叶片指标，发现随着树龄的增长，红锥叶片表型变异相当丰富，在长期进化过程中对环境的适应能力强；各性状在种源间和种源内差异均达极显著水平，受环境影响较大；种源间和种源内存在广泛的变异，选择空间较大，为后期的遗传改良奠定基础。该结果与其他木本植物如珙桐Davidiainvolucrata[34]、大别山山核桃Carya dabieshanensis[35]、青杨Populuscathayana[36]等研究结果基本一致。其中，云南景洪的红锥叶长、叶宽和叶面积总体上显著大于其他种源，这可能与云南景洪的海拔较高有关。

变异系数可揭示叶片表型性状的变异程度，变异系数越大，说明离散程度越大，性状越不稳定。本研究中红锥叶片的表型性状的变异系数变幅较大(3.2%～15.6%)，且以叶柄长的变异系数最大，但低于前人研究[27]，可能是叶片性状较少的缘故。表型分化系数均值为12.62%，种源内方差分量百分比(48.404%)明显大于种源间(11.423%)，说明红锥叶片表型性状在种源间变异程度较低，种源间分化程度较低；种源内变异较为丰富，是其表型性状变异的主要来源，需要加以保护利用。该结果与李小琴等[37]、罗芊芊等[38]和王旭军等[24]的研究结果一致。本研究红锥种源间叶表型分化程度较低，可能与该物种分布较为狭窄，地理位置较近有关。鉴于此，在收集保存红锥种质资源时，应选择多样性高的种源，优先收集表型变异丰富的个体。重复力可以说明无性系间的变异主要由遗传与稳定的环境因素引起还是由随机环境因素引起，性状的重复力大，说明该性状受遗传控制较强，受随机环境因素影响较弱[39]。本研究各性状重复力在0.523～0.678 之间，大于0.5，受中等以上的遗传控制，说明红锥叶片表型性状主要受遗传因素制约，受培育条件和环境效应影响较小。其中叶柄长的重复力最高，且变异系数最大，说明叶柄长变异大，可能更有助于优良无性系的选择。叶柄长度对植物的生长和适应环境起着重要的作用，长叶柄可以使叶片远离茎部，增加叶片的曝光面积，帮助叶片更好地接收阳光，增强光合作用，还可以使叶片远离地面，降低叶片受到病菌、虫害的风险。短叶柄可以使叶片紧贴茎部，减少水分蒸发，适应干燥的环境。短叶柄还可以减少叶片和茎部之间的机械应力，提高植物的稳定性。总之，长叶柄和短叶柄在生物学上都有其适应环境的优势，能够帮助植物更好地适应其生长环境。因此，后期可以进一步研究叶柄对于植物生长的影响。

3.2 红锥叶片性状相关性分析及地理变异规律

红锥叶片各性状间存在较强的相关性，其中，叶长、叶宽及叶面积两两间存在极显著正相关，与唐庆兰等[40]研究结果一致。基于种源水平进行表型变异分析，在空间维度上研究植物表型性状与地理–气候因子间的关系，可以更准确地揭示植物变异规律[41]。通常情况下，经纬度和海拔的梯度变化能够综合反映气温、降水和植被等环境因子的作用[42]。由于地理位置和环境因子的影响，植物会形成不同的地理变异模式[43]。红锥叶片表型性状与原产地地理因子相关性分析表明，红锥的叶长、叶宽和叶面积呈现以经度和海拔变异为主的地理变异模式，这与斑皮柠檬桉叶片[40]、澳洲南部植物[44]的研究结果相似。本研究中叶面积与经度极显著负相关，叶长和叶宽显著负相关，表明经度低的种源比经度高的种源的叶片生长的更大些；叶长、叶宽和叶面积与海拔呈显著正相关，表明海拔高的种源比海拔低的种源叶片更大些；而纬度、年均温和年降水量与所有叶片指标均无显著相关性，表明影响红锥叶片性状变异的地理因子主要是经度和海拔，也进一步说明经度和海拔对植株叶片的生长影响较大。其中，纬度与叶片各性状均无显著相关性，可能与涉及的叶片表型性状数量较少或种源分布地的纬度跨度远小于经度跨度有关。由于红锥优树嫁接后的生长可能会受遗传、砧木以及接穗等因素影响，本研究的红锥叶片来自经过嫁接后的无性系，其形态特征可能受到嫁接技术以及砧木的影响，可能并非完全与地理环境因子相关，需进一步结合种源和家系综合分析，提高选择的科学性。

聚类分析结果表明，17 个种源可划分为3 个类群。在供试的红锥17 个自然种源中，云南景洪种源的叶长、叶宽和叶面积均大于其他种源，云南思茅种源的叶柄最长，云南的两个种源均聚在第3 类；而广东信宜种源的叶长、叶宽和叶面积较小，聚在第2 类。广东始兴种源的叶形指数值最小，聚在第2 类；湖南江华种源的叶柄最短，广东陆河种源的叶形指数最大，聚在第1 类。第1类和第2 类种源中既有地理分布相近的种源，也有地理分布相差较远的种源。地理变异模式主要有区域变异和随机变异，由于种源地理分布隔离，导致花粉和种子在种源间难传播，即使种源间地理距离较近，其基因交流也较少。因此自然界中大多为随机变异。