长链非编码RNAMIR22HG和微RNA-9-3p在骨关节炎病人血清中的表达及与病情严重程度的相关性

尹文平，陈丹，包旭佳

作者单位：南充市中医医院，a骨伤四科，b内二科，四川 南充 637300

骨关节炎（osteoarthritis， OA）是最常见的关节退行性疾病之一，其特点是软骨逐渐退化，软骨下骨增厚，骨刺形成增加［1］。OA 病人的身体和经济负担是巨大的，随着人口老龄化，其影响到总人口的15%，而60岁以上的老年人口占50%［2］。因此，探索与OA 相关的生物标志物对OA 的治疗十分重要。长链非编码RNA （long non-coding RNAs， lncRNAs）作为一组核苷酸长度大于200 的非编码RNA，已被证实与多种疾病的发病机制有关，越来越多的研究表明，大量lncRNA 异位表达于OA 软骨中，参与了OA 的发生发展［3］。MIR22HG 是最近发现的一种lncRNA，被发现与许多癌症的发生和进展有关［4］。研究发现，MIR22HG 在受损的膝关节软骨中显著上调［5］。miRNA 是非编码小分子RNA，可以调节细胞的增殖、分化和凋亡［6］。miR-9-3p 是具有多种功能的miRNA，在细胞炎症、增殖以及分化过程中起关键的调控作用［7］。有研究证实miR-9 在OA 中低表达，是OA 的潜在保护因子［8］。因此推测lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 可能与OA 的发生、发展存在联系。本研究通过检测OA 病人与健康体检者血清lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 的表达水平，探讨lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p与病情严重程度的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2020 年10 月至 2021 年10 月在南充市中医医院确诊为OA 的病人120 例，为OA组，采用随机数字表法选择体检健康者60例为对照组。由两名影像学专家对OA 病人严重程度进行膝关节骨性关节炎（KL）分级，如果出现意见不同，则由更高职称的影像学专家进行判定。影像KL 分级分为Ⅰ级到Ⅳ级，本研究OA病人为Ⅱ级34例，出现少量骨赘，存在关节间隙变窄；Ⅲ级42例，骨赘增生比Ⅱ级多，软骨硬化，间隙变窄；Ⅳ级44 例，关节间隙狭窄或基本消失，有明显的畸形现象［9］。研究已经通过南充市中医医院伦理委员会审核批准（批号2020-0812），所有病人均知情并签署知情同意书。纳入标准：（1）符合OA 诊断及治疗指南的诊断金标准［10］；（2）符合OA 的临床和影像学诊断标准；（3）存在骨摩擦音，骨关节疼痛持续近1个月。排除标准：（1）其他慢性疾病或其他炎症性疾病者；（2）既往曾有继发性关节炎或创伤性关节炎病人；（3）患有自身免疫性疾病者；（4）病人伴有精神疾病或认知功能障碍，无法配合完成本研究。一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。

表1 骨关节炎（OA）组与健康对照一般资料比较

1.2 评分方法对OA 病人进行视觉模拟评分（VAS）、美国特种外科医院膝关节评分（HSS）、西安大略和麦马斯特大学骨关节炎指数可视化量表（WOMAC）。VAS 评分为0～10 分，0 分无痛，3 分以下有轻微疼痛，4～6分疼痛到影响睡眠，7～10分病人疼痛难忍，分值越高越严重；HSS 评分分为5 个等级，共计100分，≥86为优秀，75～85为良好，60～74为中，＜60为差，分值越低越严重；WOMAC评分是由关节疼痛、僵硬和功能三个方面构成，共有24个问题，每个问题分值为0～4，分值越高越严重［10］。

1.3 lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 水平检测方法OA 组病人于入院后第2天清晨，对照组于体检当天清晨分别取其静脉血3 mL，离心，分离上清，将血清于-80 ℃储存，避免反复冻融影响实验。采用TRIzol试剂（货号Invitrogen，上海文韧生物科技有限公司）提取血清的总RNA。使用SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（货号DRR041A，日本Takara 公司）对分离的RNA 进行逆转录。使用SYBR Green PCR Master Mix（货号CD-06271-ML，武汉纯度生物科技有限公司）在荧光定量PCR 仪（美国ABI-7300）中进行实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）。以U6和GAPDH 作为内部对照。二者表达水平用2-ΔΔCt法估算。本研究中用于qRT-PCR 的引物序列如表2所示，引物由上海杏园瑞民生物工程有限公司合成。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 统计学方法数据处理使用SPSS 25.0 软件完成。计量数据用±s表示，两组比较采用独立样本t检验分析；三组间的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。计数资料用例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson 法分析OA 病人血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 的相关性以及二者与VAS 评分、HSS 评分和WOMAC 评分等指标的相关性；受试者操作特征（ROC）曲线分析血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 对OA 的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OA 组和对照组血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 的表达水平比较OA 组的血清中lncRNA MIR22HG 的表达水平显著高于对照组，miR-9-3p 的表达水平显著低于对照组，均差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 OA组和对照组血清中lncRNA MIR22HG、miR-9-3p的表达水平比较/± s

注：lncRNA为长链非编码RNA，miR-9-3p为微RNA-9-3p。

组别对照组OA组t值P值miR-9-3p 1.05±0.12 0.72±0.13 16.46＜0.001例数60 120 lncRNA MIR22HG 1.01±0.22 1.48±0.25 12.36＜0.001

2.2 血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 表达水平相关性相关性分析结果显示，OA 组病人血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 的表达水平呈负相关关系（r=-0.44，P＜0.001）。如图1所示。

图1 血清中lncRNA MIR22HG和miR-9-3p表达水平相关性

2.3 病情严重程度不同的OA 病人血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 表达水平比较KL Ⅳ级血清lncRNA MIR22HG 的表达水平显著高于KL Ⅲ级和KL Ⅱ级（q=5.22，P=0.045；q=8.39，P＜0.001），KLⅢ级表达水平显著高于KL Ⅱ级（q=3.42，P=0.001）；KL Ⅳ级血清miR-9-3p 的表达水平显著低于KL Ⅲ级和KL Ⅱ级（q=8.31，P＜0.001；q=12.26，P＜0.001），KL Ⅲ级表达水平显著低于KL Ⅱ级（q=4.37，P=0.007）。见表4。

表4 病情严重程度不同的OA病人血清中lncRNA MIR22HG和miR-9-3p表达水平比较/± s

表4 病情严重程度不同的OA病人血清中lncRNA MIR22HG和miR-9-3p表达水平比较/± s

注：lncRNA 为长链非编码RNA，miR-9-3p 为微RNA-9-3p，KL 为膝关节骨性关节炎。①与KL Ⅱ级比较，P＜0.05。②与KL Ⅲ级比较，P＜0.05。

例数34 42 44 lncRNA MIR22HG 1.31±0.24 1.45±0.25①1.65±0.26①②18.18＜0.001组别KL Ⅱ级KL Ⅲ级KL Ⅳ级F值P值miR-9-3p 0.84±0.10 0.75±0.13①0.59±0.14①②39.82＜0.001

2.4 病情严重程度不同的OA 病人的VAS 评分、HSS评分以及WOMAC 评分KL Ⅳ级病人的VAS评分和WOMAC 评分显著高于KL Ⅲ级和KL Ⅱ级（q=6.68，P＜0.001；q=9.86，P＜0.001 和q=3.84，P=0.021；q=7.36，P＜0.001），KL Ⅲ级病人评分显著高于KL Ⅱ级（q=3.51，P=0.038 和q=3.69，P=0.027）；KLⅣ级病人的HSS 评分显著低于KL Ⅲ级和KL Ⅱ级（q=5.88，P＜0.001 和q=10.35，P＜0.001），KL Ⅲ级病人评分显著低于KL Ⅱ级（q=4.75，P=0.003）。见表5。

表5 病情严重程度不同的OA病人的VAS评分、HSS评分以及WOMAC评分比较/（分，± s）

表5 病情严重程度不同的OA病人的VAS评分、HSS评分以及WOMAC评分比较/（分，± s）

注：VAS 为视觉模拟评分，HSS 为美国特种外科医院膝关节评分，WOMAC为西安大略和麦马斯特大学骨关节炎指数可视化量表，KL为膝关节骨性关节炎。①与KL Ⅱ级比较，P＜0.05。②与KL Ⅲ级比较，P＜0.05。

WOMAC评分60.12±7.12 64.56±7.25①68.88±7.66①②13.62＜0.001组别KL Ⅱ级KL Ⅲ级KL Ⅳ级F值P值例数34 42 44 VAS评分4.89±0.45 5.21±0.56①5.78±0.63①②25.72＜0.001 HSS评分72.19±7.34 66.66±7.11①60.25±7.02①②27.18＜0.001

2.5 OA 病人血清lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p表达水平与VAS 评分、HSS 评分以及WOMAC 评分的相关性分析相关性分析显示，OA 病人血清lncRNA MIR22HG 的表达水平与VAS 评分、WOMAC 评分均呈正相关（P＜0.05），与HSS 评分呈负相关（P＜0.05）；miR-9-3p 表达水平与VAS 评分、WOMAC 评分均呈负相关（P＜0.05），与HSS 评分呈正相关（P＜0.05）。见表6。

表6 OA病人血清lncRNA MIR22HG和miR-9-3p表达水平与VAS评分、HSS评分以及WOMAC评分的相关性分析

2.6 ROC 曲线分析血清中lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p 对OA 的诊断价值ROC 曲线显示，lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p诊断OA 发生的ROC 曲线下面积（area under curve，AUC）分别为［0.89，95%CI：（0.84，0.94）］和［0.84，95%CI：（0.81，0.91）］，灵敏度分别为87.50%和85.80%，特异度分别为78.30%和91.70%。两者联合诊断AP 的AUC 为［0.95，95%CI：（0.92，0.98）］，其灵敏度、特异度分别为89.50%和77.30%，其中二者联合诊断的AUC 高于lncRNA MIR22HG、miR-9-3p 单独诊断的AUC 值（Z=2.22，P=0.012；Z=1.43，P=0.025）。

3 讨论

OA 是人类最常见的关节疾病，临床表现为疼痛、活动受限和不同严重程度的炎症，宏观上表现为关节软骨的逐渐退化［11-12］。OA 以软骨完整性退行性丧失和关节间隙狭窄为典型，是全世界范围内导致疼痛、残疾和缩短工作寿命的主要原因［13］。不幸的是，目前还没有有效的治疗方法可以改变疾病的进展。因此，寻找对OA 疾病诊断以及治疗的生物标志物具有重要的意义。

研究表明lncRNA 与OA 的发病密切相关，与正常的骨关节相比，在OA 关节异常表达的lncRNA 大约有1 700～4 700 种［14］。lncRNA 可以调节软骨细胞功能、软骨基质代谢、滑膜细胞功能和周围血管增生，在OA 的发病过程发挥重要的作用［15］。研究表明在OA 病人血清中lncRNA MIR22HG 显著高表达，lncRNA MIR22HG 的抑制可降低细胞凋亡和软骨基质降解，表明lncRNA MIR22HG 在OA 发病机制中发挥了重要作用［16］。MIR22HG在OA关节软骨中过表达，可能是OA进展的重要因素，MIR22HG通过PTEN/AKT 通路促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化［17］。本次研究发现，OA 组的血清中lncRNA MIR22HG 的表达水平显著高于对照组；KLⅣ级血清lncRNA MIR22HG的表达水平、VAS评分、WOMAC评分显著高于KL Ⅲ级和KL Ⅱ级，KL Ⅲ级显著高于KL Ⅱ级；KL Ⅳ级病人的HSS 评分显著低于KL Ⅲ级和KL Ⅱ级，KL Ⅲ级病人评分显著低于KL Ⅱ级，提示VAS 评分、WOMAC 评分越高、HSS 评分越低，OA 病人病情越严重，lncRNA MIR22HG 的表达水平与OA 严重程度有关，MIR22HG 的表达水平越高，OA影像KL分级就越重，关节症状体征越明显；OA 病人血清lncRNA MIR22HG 的表达水平与VAS 评分、WOMAC 评分均呈正相关，与HSS 评分呈负相关；提示lncRNA MIR22HG 与OA 病人的病情严重程度存在联系，可以作为评估OA 病情的潜在生物学指标。

MicroRNAs是一种小的、高度保守的RNA，被认为可以快速调节细胞对环境条件变化的反应，如细胞分化、癌症发展、炎症或缺氧应激［18］。miRNAs 与OA 的发病过程，如骨代谢、炎症以及软骨内稳态有关［19］。研究表明miR-140、miR-9和miR-146a在骨骼发育过程中发挥重要的作用，与正常的组织相比，在OA 病人软骨组织中，miR-140、miR-9 和miR-146a的表达量是减少的［20］。目前的研究中，发现miR-9通过成纤维细胞样滑膜细胞中的NF-κB1-RANKL通路抑制关节炎，除此之外，MIR22HG 还通过miR-9-3p/ADAMTS5 通路参与调节细胞增殖、凋亡和软骨基质退变［21］。本次研究表明，OA组miR-9-3p的表达水平显著低于对照组；KL Ⅳ级血清miR-9-3p的表达水平显著低于KL Ⅲ级和KL Ⅱ级，KL Ⅲ级表达水平显著低于KL Ⅱ级，提示miR-9-3p 的表达水平越低，OA影像KL分级就越重，关节症状体征越明显；miR-9-3p表达水平与VAS 评分、WOMAC 评分均呈负相关，与HSS 评分呈正相关，表明miR-9-3p在一定程度上参与OA 的发生，miR-9-3p 表达与病情严重程度密切相关。

研究结果显示，OA 组病人血清中lncRNA MIR22HG和miR-9-3p的表达水平呈负相关关系，表明二者共同参与OA 的发生，二者联合诊断的AUC高于单独诊断值，推测lncRNA MIR22HG 和miR-9-3p对OA的诊断具有一定的价值。

综上所述，OA 病人血清中lncRNA MIR22HG 表达水平显著增加，而miR-9-3p 表达水平显著降低，二者表达呈负相关，二者与病情严重程度密切相关。由于OA 的作用机制比较复杂，研究结果有待更加深入的研究来证实。