黑藻多肽亚铁螯合物的制备及其抗氧化活性研究

唐裕芳，吕 秀，王 唯，石 宇

(湘潭大学 化工学院，湖南 湘潭 411105)

0 引言

多肽一般由2～100个连续氨基酸组成，为蛋白质水解中间产物，具有很高的营养价值.目前，越来越多的研究表明，多肽具有抗氧化[1]、降血压[2]、抑菌[3]、免疫调节[4]等多种生物活性.多肽的生物活性一般受蛋白一级结构的影响，如果要进一步提高多肽的生物学效用，有必要对多肽结构进行相应的修饰处理，即在多肽的氨基和羧基上引入糖类、脂类、微量元素等基团，增强多肽的功能活性或赋予多肽其他的优良性质.分子修饰是解决制约活性肽发展与应用问题行之有效的策略之一，也是近年来食品科学和药学领域研究中的一个重要发展方向.目前已报道的多肽的化学修饰大多集中在抗菌肽上，抗氧化肽的化学修饰研究相对较少.多肽氨基酸序列上富含氨基和羧基，通过其氨基氮原子或羧基上氧原子与金属螯合反应是多肽化学修饰的策略之一[5-7].目前，多肽螯合的金属种类主要有铁、钙、锌、硒等，且研究发现多肽螯合金属后，其抗氧化活性显著增强，如豌豆低聚肽螯合硒后对1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基(ABTS+·)和羟基自由基(·OH)的清除能力高于豌豆低聚肽[8]，大竹蛏多肽螯合钙后抗氧化性增强，相当于α-生育酚的71.08%[9]，大豆多肽螯合亚铁后对DPPH·、ABTS+·及·OH的清除能力增强[10].同时，相比传统的补铁剂、补锌剂、补钙剂，多肽螯合铁、锌、钙、硒等金属后，使铁、锌、钙、硒稳定性增加，生物效价提高，更易于被肠道吸收.因此，多肽金属螯合物不仅能满足人们对氨基酸的需求，还能促进铁、锌、钙、硒离子的吸收，对维持机体健康起着非常重要的作用.同时，多肽金属螯合物较强的抗氧化性能还能激活机体中的抗氧化信号通路，缓解机体因环境胁迫而造成的氧化损伤.

黑藻属于水鳖科黑藻属植物，蛋白含量约有25%，小部分被用作鱼类饵料、饲料，农田绿肥外，大部分直接被丢弃.所以，对黑藻深入开发研究，进行高附加值转化可解决资源浪费和环境污染问题.目前，本课题组已制备了黑藻多肽并研究了黑藻多肽的抗氧化活性，发现黑藻多肽具有较强的自由基清除性能[11]，但利用黑藻多肽制备黑藻多肽亚铁螯合物增强黑藻多肽抗氧化性的研究鲜见报道.因此，本研究通过单因素实验确定制备黑藻多肽亚铁螯合物的最佳条件，并对黑藻多肽亚铁螯合物的结构和抗氧化活性进行了探究.本研究以期为黑藻高值化提供基础数据和理论参考.

1 材料与方法

1.1材料与试剂

黑藻粗蛋白粉，西安朗德生物科技有限公司；1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、氯化亚铁、无水乙醇、盐酸羟胺、乙酸钠、邻二氮菲、L-抗坏血酸(VC)，上海麦克林生化科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯.所用到的水均为去离子水.

1.2 仪器与设备

THZ-82型水浴恒温振荡器；Agilent Cary 3500型紫外-可见分光光度计；Nicolet 380型傅里叶红外光谱仪；DZF-6050AB型真空干燥箱；H1850型医用离心机.

1.3 方法

1.3.1 黑藻多肽亚铁螯合物的制备

1)黑藻多肽的制备：黑藻多肽制备参照本课组前期研究[11].黑藻粗蛋白粉以料液比1∶10充分溶于去离子水中，过滤，所得滤液中加入80%硫酸铵饱和溶液，充分搅拌后分装于离心管中，于4 ℃静置12 h后离心10 min(8 000 r/min).然后，收集离心管底的沉淀，并用去离子水溶解后装于透析袋中于4 ℃条件下透析48 h.最后，透析袋中的溶液经冷冻干燥后得黑藻蛋白粉.黑藻蛋白粉先充分溶于去离子水中，以酶底比8.6%加入胰蛋白酶，将溶液pH值调到7.3后，于37 ℃条件下水解5.9 h，水解液冷冻干燥后得到黑藻多肽.

2)黑藻多肽亚铁螯合物制备：黑藻多肽溶于去离子水中，充分溶解后加入抗坏血酸，搅拌均匀，然后调整pH值，并加入氯化亚铁，恒温条件螯合反应完成后，用无水乙醇沉淀反应物，离心.所得滤渣用无水乙醇清洗3次后，真空干燥获得黑藻多肽亚铁螯合物.

3)黑藻多肽亚铁螯合物螯合工艺优化：考察黑藻多肽螯合亚铁反应中多肽和氯化亚铁质量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、8∶1、10∶1)、反应溶液pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、螯合温度(20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)、抗坏血酸添加量(1.5 mg/mL、4.5 mg/mL、7.5 mg/mL、10.5 mg/mL、13.5 mg/mL)、时间(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)对螯合率的影响，以确定黑藻多肽与亚铁螯合反应的最佳条件.

4)黑藻多肽亚铁螯合物纯度检测：①取一定量制备的黑藻多肽亚铁螯合物加入50 mL乙醇，搅拌30 min后离心，取适量上清，加入过量的硫化钠试剂，没有黑色沉淀(FeS)生成，说明螯合物中游离亚铁离子已除净；②取适量黑藻多肽亚铁螯合物于烧杯中，用蒸馏水溶解，加3～5滴茚三酮，加热煮沸2～3 min，溶液颜色没有变为蓝色，说明螯合物中游离多肽已除净.

5)多肽螯合亚铁离子螯合率的测定：采用邻菲罗啉比色法测定多肽亚铁螯合物的亚铁离子质量，以不加亚铁离子的标准液为空白对照，在波长510 nm处测定吸光值，根据所得标准曲线y=0.04x+0.000 2(R2=0.999 9)，计算多肽亚铁螯合物中的亚铁离子质量.螯合率(η)的计算公式如式(1)所示：

(1)

式中：m0为反应溶液中亚铁离子起始质量的数值，单位mg；m为多肽亚铁螯合物中的亚铁离子质量的数值，单位mg.

1.3.2 黑藻多肽亚铁螯合物的表征

1)紫外-可见分光光谱分析：将黑藻多肽、黑藻多肽亚铁螯合物和Vc配置成100 μg/mL的溶液，进行紫外全波长扫描(扫描范围为200～400 nm).

2)傅里叶红外光谱分析：取少量黑藻多肽、黑藻多肽亚铁螯合物和Vc分别与干燥的溴化钾研磨混合均匀，然后将混合粉末压成1 mm的薄片，并进行红外光谱扫描(扫描范围为4 000～500 cm-1).

1.3.3 抗氧化活性测定

1)DPPH·清除率的测定：DPPH·清除率的测定参照唐裕芳等[11]、周蓉等[12]描述的方法，稍做修改.配制0.1 mmol/L 的DPPH-甲醇溶液，0.5 mg/mL的多肽、多肽亚铁螯合物及VC溶液，VC为正对照.测试组，先分别取样品液25 μL、50 μL、100 μL和200 μL，再依次分别加入475 μL、450 μL、400 μL和300 μL水，最后再加入500 μL DPPH-甲醇溶液，使得体系溶液总体积为1 mL；阴性对照组，以500 μL的甲醇溶液代替500 μL DPPH-甲醇溶液；空白组，依次加入500 μL水和500 μL DPPH-甲醇溶液.各组摇匀混合后室温避光静置30 min，于517 nm处测定吸光值.DPPH·清除率(r)的计算如式(2)所示.

(2)

式中：Ai为测试组样品的吸光度值；Aj为阴性对照组样品的吸光度值；A0为空白组样品的吸光度值.

2)ABTS+·清除率的测定：ABTS+·清除率的测定参照唐裕芳等[11]描述的方法，稍做修改.取0.2 mL 7.4 mmol/L ABTS储备液和0.2 mL 2.6 mmol/L过硫酸钾储备液混合均匀后，避光室温放置12 h.临用前混合液用pH 7.4的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液稀释40～50倍，使其在734 nm处的吸光值为0.7±0.02，即得ABTS+·工作液.配制0.66 mg/mL的多肽、多肽亚铁螯合物和VC溶液，VC为正对照.测试组，先分别取25 μL、50 μL、100 μL和200 μL样品溶液，再分别依次加入800 μL ABTS+·工作液，最后往各管中补加一定体积的水，使得体系溶液总体积为1 mL；阴性对照组，以800 μL的磷酸盐缓冲液代替ABTS+·工作液；空白组，依次加入200 μL的磷酸盐缓冲液和800 μL ABTS+·工作液.各组混合均匀后室温避光反应10 min，在734 nm处测定吸光值.ABTS+·清除率的计算如式(2)所示.

3)·OH清除率的测定：·OH清除率的测定参照唐裕芳等[11]述的方法，稍做修改.配制9 mmol/L的水杨酸-乙醇、9 mmol/L的FeSO4·7H2O和8.8 mmol/L H2O2溶液以及4 mg/mL的多肽、多肽亚铁螯合物和VC溶液，VC为正对照.测试组，先分别取37.5 μL、75 μL、150 μL和300 μL样品溶液，依次加入300 μL FeSO4·7H2O溶液，300 μL H2O2溶液，最后再补加入一定体积水，使得体系溶液总体积为900 μL；阴性对照组，以300 μL水代替300 μL H2O2溶液；空白组，依次加入300 μL水，300 μL FeSO4·7H2O溶液和300 μL H2O2溶液.各组摇匀10 min后，再加入300 μL的水杨酸-乙醇溶液，37 ℃水浴30 min，避光冷却到室温，在510 nm处测定吸光值.·OH清除率的计算如式(2)所示.

1.4 数据分析

所有试验均重复3次，利用Origin 2018进行数据的统计分析和绘图，数据结果均表示为平均值±标准差.

2 结果分析与讨论

2.1 单因素试验

根据文献调研，螯合温度、pH、时间、多肽与氯化亚铁质量比和抗坏血酸添加量都会影响黑藻多肽与金属的螯合率[13]，所以本文探究了以上几个因素对黑藻多肽亚铁螯合物螯合率的影响，实验结果如图1所示.

由图1(a)可知，温度对螯合率有显著影响.当温度从20 ℃升到30 ℃，螯合率从32.99%迅速提高至64.20%并达到最大.当温度继续升高至50 ℃，螯合率下降至32.97%.温度进一步上升至60 ℃，螯合率轻微上升.在一定的温度范围内，温度越高，分子间运动加快，有利于螯合反应的进行.但温度太高，分子间运动过于剧烈，不利于螯合反应进行[14].螯合反应属于放热反应，且高温会改变多肽构象，使得多肽的结合位点发生改变，进而影响多肽和亚铁离子的结合[15]，这可能是螯合率在60 ℃有轻微上升的原因.这与刘晶晶等[16]的研究结果一致，过高或过低的温度都不利于螯合反应的进行.因此，选定30 ℃为黑藻多肽螯合亚铁的最佳温度.

图1 不同因素对黑藻多肽亚铁螯合物螯合率的影响：(a)温度；(b)pH；(c)时间；(d)多肽与氯化亚铁质量比；(e)抗坏血酸添加量Fig.1 The effect of different factors on the chelation rate of HVR polypeptide Ferrous-chelate：(a)Temperature；(b)pH；(c)Time； (d)Mass ratio of polypeptide to FeCl2；(e)Amount of ascorbic acid

由图1(b)可知，随着pH的升高，螯合率呈现先上升后下降的趋势.在pH 4.0～7.0范围内，螯合率由36.52%上升至62.83%.随着pH值继续上升，螯合率下降.在偏酸性条件下，溶液中存在大量的氢离子，导致其和二价铁离子形成竞争关系，不利于二价铁离子和多肽的螯合反应[17].在偏碱性条件下，溶液中大量存在的氢氧根离子与二价铁离子生成氢氧化亚铁，氢氧化亚铁极易被氧化成氢氧化铁而生成沉淀，导致较少的二价铁离子和多肽进行螯合反应[16].在钙离子和猪骨肽及南极磷虾蛋白水解物的螯合中也发现了类似的结果[18].因此，选定pH 7.0为黑藻多肽螯合亚铁最佳pH值.

由图1(c)可知，随着反应时间的延长，螯合率先上升后下降.在第30 min，螯合率达到最大为63.83%.在较短时间内，二价铁离子和黑藻多肽反应不充分，导致螯合率较低.但螯合时间较长，螯合上的二价铁离子又会解离下来，导致螯合率下降.这和Zhang等[19]的研究结果一致.这结果也说明黑藻多肽能快速螯合亚铁离子.因此，选定的最佳黑藻多肽螯合亚铁时间为30 min.

由图1(d)可知，在多肽和氯化亚铁质量比为8：1时，螯合率达到最大为63.43%.再增加质量比时，螯合率反而会下降.这可能是因为当质量比小于8：1时，螯合体系中没有足够的多肽和二价铁离子进行反应，导致螯合率偏低.当质量比大于8：1时，反应液离子强度增大，黏度增大，含铁量较小，多肽和亚铁离子接触面积较小，导致螯合率降低，且易造成原料的浪费[14].因此，选定的最佳黑藻多肽和氯化亚铁质量比为8：1.

由图1(e)可知，VC浓度由1.5 mg/mL增加到4.5 mg/mL时，螯合率由42.12%升高64.53%，并达到最大.但随着VC浓度进一步增加，螯合率下降.二价铁离子不稳定易转变为三价铁离子，而VC是一种抗氧化剂，可以防止这种转变.在VC浓度较低时，抗氧化作用弱，二价铁离子容易生成了氢氧化铁沉淀，导致螯合率下降.在VC浓度太高时，不仅增加VC用量，并且降低螯合反应体系的pH，导致螯合率下降[20].因此，选定的最佳VC添加量为4.5 mg/mL.

2.2 黑藻多肽亚铁螯合物的表征

图2(a)为黑藻多肽亚铁螯合物、黑藻多肽、氯化亚铁和Vc的紫外光谱图.从图2(a)可知，氯化亚铁在紫外区域没有吸收.黑藻多肽的最大吸收峰206.2 nm处，而黑藻多肽亚铁螯合物的最大吸收峰蓝移至200.7 nm，推测可能是由于多肽螯合亚铁离子后，螯合物中多肽的某些基团结构改变，使基团的电子跃迁能级发生改变所致[21].上述结果与杨玉蓉等[22]的研究结果相似，表明黑藻多肽和亚铁离子发生了配位螯合反应生成了新物质，即黑藻多肽亚铁螯合物.Vc溶液的最大吸收峰在240～260 nm，而黑藻多肽亚铁螯合物在此范围内并没有出现吸收峰，说明黑藻多肽亚铁螯合物中没有残留的Vc.

图2(b)为黑藻多肽亚铁螯合物、黑藻多肽和Vc的FT-IR光谱图.由图2(b)可知，多肽与二价亚铁离子螯合后，在3 700～3 000 cm-1的羟基和氨基伸缩振动导致的叠加峰[23]信号增强，可能是黑藻多肽中的羟基和氨基与二价铁进行了螯合；1 400 cm-1左右的黑藻多肽氨基酸残基侧链基团-COO-伸缩振动峰[24]红移至1 408 cm-1，并且信号减弱，表明羧基氧也是亚铁离子螯合位点之一[25].酰胺Ⅰ带(1 700～1 800 cm-1)是由C=O伸缩振动引起的，酰胺Ⅱ带(1 600～1 500 cm-1)是由N-H的弯曲振动和C-N的伸缩振动引起的.黑藻多肽和二价铁螯合后在酰胺Ⅰ带吸收峰没有发生位移，而在酰胺Ⅱ带的吸收峰位置由1 551.07 cm-1蓝移至1 500.29 cm-1，表明亚铁离子和多肽酰胺键上的N-H和C-N键配合，这一研究结果在桃仁多肽中也有类似发现[22].羧基离子的反对称振动峰在1 650 cm-1附近，对称振动峰在1 400 cm-1附近，这两波数处的吸收峰信号在螯合前后均出现强弱变化，推测羧基可能以共价键的方式和铁离子结合[14，26].这些结果表明黑藻多肽中的氨基、羧基、羟基、酰胺键可能参与了与亚铁离子的螯合反应，进一步证实了螯合物的形成.1 300～1 400 cm-1是指纹区，每个化合物都有相对应的指纹吸收.1 322 cm-1处的吸收峰为Vc的C-O-C不对称伸缩振动模式，1 764 cm-1处的吸收峰为Vc的C=O伸缩振动模式，1 027 cm-1处的吸收峰为Vc的C-O-C对称伸缩振动模式[27]，但在黑藻多肽亚铁螯合物中并没有发现这些特征吸收峰，说明黑藻多肽亚铁螯合物中没有残留的Vc.

图2 黑藻多肽亚铁螯合物及黑藻多肽的紫外光谱图(a)和傅里叶红外光谱图(b)Fig.2 (a)UV-Vis and (b)FT-IR spectra of HVR polypeptide Ferrous-chelate and HVR polypeptide

2.3 黑藻多肽亚铁螯合物的抗氧化活性评价

2.3.1 DPPH·清除作用

本工作探索了黑藻多肽亚铁螯合物的抗氧化活性，其对DPPH·、ABTS+·、·OH的清除率如图3所示.

由图3(a)可知，随着螯合物的浓度从12.5 μg/mL增大至100 μg/mL，螯合物对DPPH·清除率从4.32%增加至80.51%，而黑藻多肽在此测试浓度范围内对DPPH·清除率最高仅有0.19%.黑藻多肽亚铁螯合物浓度为100 μg/mL时，对DPPH·清除率(80.51%)高于李文军等[10]研究的大豆多肽铁螯合物在4 000 μg/mL时的清除率(78.37%).这可能是因为不同来源的多肽和亚铁离子结合后，空间构象发生变化不一致，暴露出来的可为DPPH·提供电子或质子基团的种类不同导致[28].黑藻多肽亚铁螯合物的DPPH·清除活性IC50值为66.06 μg/mL，而段秀[29]研究的罗非鱼皮胶原蛋白肽亚铁螯合物的DPPH·清除活性IC50值为840 μg/mL.黑藻多肽亚铁螯合物的DPPH·清除率虽弱于阳性对照VC，但仍呈现出较高活性.

2.3.2 ABTS+·清除作用

由图3(b)可知，随着螯合物浓度从16.5 μg/mL增大至66 μg/mL，螯合物对ABTS+·清除率从28.09%增大至97.14%.而黑藻多肽在此测试浓度范围内对ABTS+·清除率最高仅有28.29%.黑藻多肽亚铁螯合物对ABTS+·的清除能力高于李文军等[10]制备的大豆多肽亚铁螯合物和庞忠莉[30]制备的牡蛎亚铁螯合物.黑藻多肽和黑藻多肽亚铁螯合物对ABTS+·的IC50值分别为119.52 mg/mL和27.77 mg/mL.而段秀[29]研究的罗非鱼皮胶原蛋白肽亚铁螯合物的IC50值520 mg/mL.因此，黑藻多肽亚铁螯合物的ABTS+·清除能力与文献中报到的螯合物相比具有较大的优越性.

2.3.3 ·OH清除作用

由图3(c)可知，在125～500 μg/mL范围内，随着浓度增加，黑藻多肽和黑藻多肽亚铁螯合物的·OH清除率呈增长趋势.而在500～1 000 μg/mL范围内，黑藻多肽和黑藻多肽亚铁螯合物的·OH清除率增长缓慢，且在1 000 μg/mL两者的·OH清除率分别达到59.91%和63.26%.在测试浓度范围内，黑藻多肽亚铁螯合物对·OH的清除率显著高于黑藻多肽对·OH的清除率，这结果表明黑藻多肽亚铁螯合物的抗氧化能力高于黑藻多肽.黑藻多肽亚铁螯合物浓度为500 μg/mL时，对·OH的清除率(61.75%)明显高于2倍浓度下(1000 μg/mL)大豆多肽亚铁螯合物的·OH清除能力(约24%)[10].这可能是因为黑藻多肽和二价铁螯合后，氨基酸的组成和排列发生变化；或者是因为氨基酸的相互作用增强从而导致供氢能力增强，最终使得螯合物的·OH清除能力增强[28，31].然而相比于黑藻多肽亚铁螯合物对其他自由基的清除活性，其对·OH的清除活性较低，这可能是因为二价铁是过渡金属离子，在此条件下，超氧阴离子和过氧化氢可以产生·OH，使得螯合物的·OH清除能力较弱[29].

注：图中不同小写字母表示相同物质下不同浓度的清除率之间差异显著(p<0.05)；图中不同大写字母表示相同浓度下不同物质的清除率之间差异显著(p<0.05).图3 黑藻多肽亚铁螯合物、黑藻多肽和Vc的清除率：(a)DPPH·；(b)ABTS+·；(c)·OHFig.3 The scavenging rate of HVR polypeptide Ferrous-chelate，HVR polypeptide and Vc：(a)DPPH·；(b)ABTS+·；(c)·OH

3 结论

通过单因素实验，确定了黑藻多肽螯合亚铁离子的最佳螯合工艺为螯合温度30 ℃、螯合pH 7.0、螯合时间30 min、多肽和氯化亚铁质量比8∶1、抗坏血酸添加量4.5 mg/mL，螯合率达64.53%.对螯合前后的物质进行光谱分析可知，二价铁和黑藻多肽中的羟基、氨基、羧基及酰胺键以共价键的形式结合.黑藻多肽螯合亚铁离子对DPPH·、ABTS+·和·OH的清除率显著提升.研究结果为研发具有更强抗氧化活性的黑藻多肽产品提供理论基础和技术支持.