柚皮素对脑缺血再灌注损伤神经保护机制及作用靶点研究进展

胡中强 杨悦 李明阔 李琛

缺血性脑卒中是卒中最常见的类型,起病急进展快,因其高发病率、高致死致残率,往往预后不良且给家庭造成较重的经济负担[1],早期诊断积极的治疗对于改善缺血性脑卒中病人后期的神经功能具有十分重要的意义。目前,缺血性脑卒中的超早期治疗主要是通过静脉溶栓以尽早恢复缺血脑组织血供,改善神经细胞缺血缺氧状态,减轻神经细胞损伤进而改善神经功能。然而,在缺血区脑组织血供恢复的同时,往往会出现神经功能一过性恢复后损伤不减反增、病情恶化的现象,即脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,I/R损伤)[2]。近年来,脑缺血再灌注损伤的相关机制吸引越来越多国内外学者的关注,成为目前研究的热点话题之一。最新研究发现,脑缺血再灌注损伤的发生机制主要与神经细胞炎性反应、氧化应激、氮化应激、酸中毒、线粒体功能障碍、Ca2+超载、细胞凋亡、能量代谢障碍、血脑屏障破坏、兴奋性氨基酸过度释放等因素密切相关[3,4],而各种机制之间相互作用、相互叠加,产生瀑布样级联反应,进一步放大再灌注神经细胞损伤加重神经功能缺失。近年研究表明,积极的缺血后处理对于减轻缺血再灌注损伤显得十分重要[5]。因此,如何减轻或避免缺血性脑卒中再灌注损伤,减轻神经细胞损伤,改善神经功能损伤,改善患者预后,提高生活质量显得极为重要。柚皮素(Naringenin,4,5,7-三羟基黄酮,NAR)是一种天然存在的二氢黄酮类化合物,一般以柚皮苷的形式存在于如葡萄柚、橘子、柠檬等芸香科植物中,是传统中药枳实、枳壳中的重要有效成分,自然界中来源广泛,而且可以通过血脑屏障,在神经系统临床用药中具有一定的先天优势[6-8]。常温下,柚皮素的水溶性和脂溶性很低,导致其口服生物利用率较低[9],在体内较难产生可靠的药效。樊慧蓉等[10]通过大鼠实验发现,柚皮素体内代谢包括Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢,代谢产物主要以Ⅱ相代谢产生的的葡萄糖醛酸结合物为主,并通过肝肾代谢后排出体外。目前,有学者通过采取制备柚皮素-PLGA纳米粒[11]、脂质体[12]、磷脂复合物[13]等的方式来提高柚皮素的生物利用率并取得了一定的成功,使得柚皮素的临床应用前景更加开阔。近年研究表明,柚皮素对于脑缺血再灌注损伤后神经保护具有显著的作用,而这是通过不同的通路或作用机制来实现的,本文就柚皮素对脑缺血再灌注损伤神经保护机制及作用靶点相关研究进展进行归纳总结,以期为柚皮素治疗脑缺血再灌注损伤机制进一步探讨与开发利用提供理论基础。

1 抗炎作用

脑梗死早期,神经细胞因缺氧缺血开始出现不可逆性损伤,在缺血中央区域形成缺血坏死区,神经细胞因缺氧缺血短时间内大量死亡,周围形成缺血半暗带(ischemic penumbra,IP),如能及时改善缺氧缺血状态,可避免形成坏死,是脑梗死现代治疗的理论基础;但坏死组织可激活体内免疫应答,激活小胶质细胞转化形成巨噬细胞,进而清除缺血坏死区脑组织,并同时诱导炎性介质产生,进一步加重周围脑组织炎性反应[14,15]。如何抑制炎性介质产生、抑制小胶质细胞激活是减轻炎性反应的关键。目前,积极有效的抗炎治疗是预防脑缺血再灌注损伤最有效的方法[16]。核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路广泛存在于机体内各种细胞,参与机体的炎症反应、应激和免疫应答,并在免疫应答的调控中起着关键作用。研究表明,NF-κB信号通路与脑缺血再灌注损伤后炎症反应关系密切,调节因子蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)可通过活化NF-κB介导的信号通路,促进白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等炎症因子的表达[17,18],而柚皮素可通过抑制蛋白激酶C的磷酸化抑制NF-κB介导的信号通路减少炎症因子的释放进而发挥抗炎作用[19]。Bai等[20]通过大鼠实验发现,柚皮素对缺血脑组织神经保护功能是通过下调核苷酸寡聚化结构域样受体2(nucleotide oligomerization domain-like receptors 2,NOD2)、受体相互作用蛋白2 (receptor interacting protein 2, RIP2)、 NF-κB、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达并上调血脑屏障紧密连接相关蛋白claudin-5蛋白的表达实现的。Olugbemide等[21]进一步研究后认为,柚皮素通过调控NF-κB和脑神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)的表达来调节氧化炎症损伤,进而改善缺氧应激小鼠的精神行为。Raza等[22]通过动物实验并分析免疫组化及免疫印迹后证实,柚皮素通过下调NF-κB的表达水平,抑制NF-κB介导的神经炎症,同时,柚皮素还可以限制神经胶质细胞的激活,抑制中枢神经系统炎症反应,进而改善神经功能及预后。Satoshi Okuyama等[23]实验发现,柚皮素对于阻止小胶质细胞和星形胶质细胞的过度激活具有显著作用,同时对缺血后海马区神经细胞死亡具有抑制作用,而海马结构是否完整与脑缺血再灌注损伤后的神经功能障碍严重程度关系密切[24]。

2 抗氧化作用

氧化应激是细胞代谢过程中一种无法避免的现象,但有学者认为过度的氧化应激可导致细胞出现死亡。作为缺血再灌注损伤的核心环节,脑缺血再灌注损伤时,神经细胞内氧化与抗氧化作用失衡,产生大量氧自由基[25],并攻击恢复血供的神经细胞和周围正常神经细胞,进一步加重神经功能损伤[26,27]。柚皮素作为一种良好的天然抗氧化剂,在脑缺血再灌注损伤的神经保护中具有重要地位,对减轻神经系统氧化反应、改善神经功能预后具有重要作用。既往研究表明,核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路在抗氧化应激过程中发挥重要作用[28],是体内调节抗氧化过程的有效途径,通过调控偶联反应和细胞抗氧化能力控制基因的表达,减少自由基产生,提高机体抗氧化作用,来维持体内氧化与抗氧化作用平衡进而使细胞处于氧化还原稳态[29],从而减少神经元凋亡以保护神经细胞[30]。研究表明,通过激活体内Nrf2/HO-1信号途径可促进抗氧化蛋白HO-1的表达从而发挥对大脑神经细胞缺血再灌注损伤的保护作用进而改善和修复受损的神经功能[31]。目前,柚皮素通过Nrf2/HO-1通路作用于机体其他细胞相关研究较为广泛,而其在神经功能保护方面机制正成为研究热点[32]。有研究发现,柚皮素治疗可降低外周血中炎细胞水平,抑制炎症因子的释放,提高Nrf2和HO-1蛋白表达,减轻细胞氧化应激[33]。王毅华等[34,35]通过构建体外原代大脑皮层神经细胞培养氧糖剥夺/再灌注(Oxygen-glucose Deprivation and Reperfusion,OGD/R)模型证实,柚皮素可通过激活Nrf2介导的抗氧化途径,改变体内氧化与抗氧化失衡状态,进而减轻神经细胞氧化损伤以保护神经功能。同时,还有研究表明,Nrf2/ARE信号通路具有抗氧化、抗细胞凋亡、神经保护等多种作用,柚皮素通过Nrf2/ARE信号通路也可减轻氧化应激并改善线粒体功能实现神经功能保护[36],但关于Nrf2/ARE信号通路更深入的研究有待进一步展开。

3 减轻脑组织水肿作用

水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是调节水分子转运的重要结构,目前已知的有13种亚型,其中水通道蛋白4 (Aquaporin 4,AQP4)主要位于中枢神经系统参与脑血管与周围神经组织水分子转运[37],研究表明AQP4与脑缺血再灌注损伤后脑水肿的形成关系密切[38]。王娟等[39]研究发现,柚皮素与肿瘤坏死因子TNF具有良好的结合性,通过减少组织中TNF的含量减轻炎性反应进而减轻脑水肿。Gaur等[40]给予50 mg/kg和100 mg/kg的柚皮素处理后大鼠脑组织水肿及氧化损伤明显减轻,同时镜下观察发现实验大鼠脑组织病理改变显著逆转。Somuncu等[41]给予脑缺血再灌注损伤后脑水肿大鼠模型上述剂量柚皮素处理,进一步研究发现柚皮素可显著降低大鼠体内升高的脑组织AQP4IL-2和8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine,8-OHDG)水平。此外,当发生缺血性卒中时,血脑屏障可因此受到破坏,作为存在于脑组织与周围血管之间的天然屏障,血脑屏障在平衡脑组织与外周交换中起重要作用,在脑组织恢复再灌注时,因缺少天然屏障的保护,神经系统内环境可发生紊乱,亦可导致水钠潴留,加重脑水肿。Han等[42]在研究中发现,柚皮素通过减轻氧化应激和细胞凋亡改善血脑屏障的损伤进而减轻神经功能损伤和脑水肿。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)介导的信号通路能够引起内皮细胞增生,致使其通透性增强,诱发血管肿瘤以及血管渗透,从而使周围水肿及炎症形成。柚皮素可通过调控VEGF信号通路抑制血管内皮生长因子的表达,抑制新生血管形成,改善神经系统水钠交换,减轻脑水肿,促进神经细胞血液灌注,改善神经功能损伤[43]。由此可见,梗死后脑组织水肿是多种因素作用的结果,柚皮素可通过不同途径分别减轻脑组织水肿,这是与脑缺血再灌注损伤病理生理发展中多因素相互作用过程相符的。

4 抗细胞凋亡作用

当脑梗死发生时,梗死中心区域脑组织因缺血发生坏死,而周围区域则表现为缺血半暗带,早期溶栓治疗旨在恢复缺血半暗带这一区域的血供,改善损伤的神经功能。而缺血半暗带区域脑组织在血供恢复的过程中常表现为延迟性程序性死亡,即细胞凋亡。细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤中起着重要的作用,可导致神经功能不可逆性损伤进一步加重,相关研究表明,这与多种因素如过量的氧自由基、炎性因子、线粒体损伤、钙超载等有关[44]。大量研究证实,缺氧诱导因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α)在减轻脑缺血再灌注损伤造成的细胞凋亡中起重要作用[45,46]。Ni等[47]通过观察发现,激活HIF-1α/VEGFA途径可以明显减轻脑脑缺血再灌注损伤。Cao等[48]研究证实,柚皮素可靶向作用于核因子-κB亚型1(Nuclear factor kappa B subunit 1,NFKB1)来调控HIF-1α/AKT/mTOR信号通路控制调节凋亡相关蛋白的表达,进而预防氧糖剥夺/再灌注诱导的PC12细胞凋亡。另有研究表明,钙离子参与体内多种细胞活动,当神经细胞灌注恢复后,细胞内出现大量钙离子,即钙超载[49]。体内钙超载主要与谷氨酸受体过度激活[50]、生物膜离子通道功能异常[51-53]、高尔基体[54]、钙调蛋白功能异常[55]等因素有关。体内过多的钙离子可通过氧化应激、内质网应激[56]及线粒体损伤[57]等多种途径诱导细胞凋亡。研究认为,柚皮素可增加钙结合蛋白含量,进而降低细胞内的游离钙离子浓度,从而改善钙超载状态,减轻细胞凋亡[58]。目前,国内外关于柚皮素对体内钙超载的影响多集中在以钙超载为中心的上下作用环节,单纯针对钙超载的相关研究比较匮乏,而钙超载是神经细胞脑缺血再灌注损伤多种作用的共同通路,因此针对柚皮素作用于脑缺血再灌注损伤后钙超载通路相关机制具有广泛研究价值。

5 调节线粒体自噬作用

线粒体是机体内生物氧化和能量转换的重要场所,通过氧化磷酸化途径为细胞内多种生命活动提供能量。当缺血缺氧时,线粒体内呼吸链结构和功能随之出现异常,功能酶活性显著降低,影响正常生物代谢及信号传导过程,进而导致线粒体损伤,神经细胞出现线粒体相关性程序性凋亡[59]。当缺血脑组织恢复再灌注时,氧化应激、炎症反应、钙超载等多种病理过程进一步加重线粒体损伤[60]。王凯华等[61]通过构建大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠模型证实,柚皮素可增强线粒体自噬来减少细胞内肿胀损伤的线粒体,进而减轻神经细胞凋亡,发挥神经保护作用。同时,有研究发现,当缺血脑组织恢复再灌注时,可导致线粒体自噬过度激活,使得结构和功能完整的线粒体一同被清除[62]。因此,在恢复再灌注减轻细胞损伤的同时,如何避免线粒体自噬过度激活显得尤为重要。国内外研究发现,柚皮素对于线粒体自噬的调节,可能与腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)介导的信号通路有关[63,64]。但是目前更进一步的研究较为缺乏,而线粒体自噬作为脑缺血再灌注损伤中重要的一个环节,与氧化应激、炎症反应、钙超载等多种病理过程和细胞凋亡关系密切,对于神经细胞保护起着承上启下的作用,因此,针对柚皮素对于线粒体自噬调节的研究需要进一步补充。

脑梗死是目前威胁人类健康的一大常见原因,因其高致残、高经济负担被人们所忌惮,超早期静脉溶栓对恢复梗死区域缺血半暗带脑组织血供、减轻神经功能损伤、改善患者预后具有关键作用,是目前治疗脑缺血性卒中血管内治疗最主要的手段之一。然而,在缺血脑组织恢复血供的同时,再灌注损伤却能导致本未完全恢复的神经损伤进一步加重,如何减轻脑梗死患者超早期静脉溶栓后再灌注损伤是目前国内外研究的热点话题之一。脑梗死溶栓后再灌注损伤绝非单一机制造成的,而各种机制之间又相互影响相互作用,形成滚雪球效应,损伤不断放大,加重神经功能损伤。然而现阶段研究多针对脑缺血再灌注损伤的某一个环节或靶点展开,不能够整体而系统的把握疾病发展与转归,这与脑缺血再灌注损伤各机制相互作用、瀑布样放大的病理发展特征背道而驰,整体而系统的把控脑缺血再灌注损伤发病机制,对于疾病的更深层次的研究及治疗显得尤为重要。

柚皮素作为一种广泛存在的天然药物,价格低廉,副作用小,广泛应用于多个中药方,对于脑梗死患者的治疗已具有一定的经验。近年来,柚皮素在脑缺血再灌注损伤神经保护机制及作用靶点研究中取得了大量令人瞩目的成果,其透过血脑屏障的能力暗示着其在神经系统用药的广泛前景。柚皮素可以同时作用于脑缺血再灌注损伤疾病转归中的多个节点减轻神经细胞损伤改善神经功能,通过调控体内多种信号通路发挥其抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡等作用实现保护脑缺血再灌注损伤后神经功能的目的。但是柚皮素在脑缺血再灌注损伤神经保护机制及作用靶点的研究仍有许多方面需要进一步深入。首先,目前大量研究发现柚皮素对于脑缺血再灌注损伤神经保护作用确切且对于其作用机制与作用靶点具有一定了解,但是如上所述,为发挥更好的疗效,仍有一部分机制需要进一步明确。其次,柚皮素虽已实现大量制备且实验中可稳定释放药效,但该药物研究主要处在动物实验阶段,而在临床试验研究阶段相对较少,因此需要对柚皮素进一步探索和研究,争取早日开展规范、正规的临床试验,以期为实现早日临床推广提供充分的理论依据。相信随着动物实验研究的有序进展和临床实践的逐步推进,柚皮素在脑缺血再灌注损伤神经保护机制及作用靶点的研究定会取得突破性进展,柚皮素在脑缺血再灌注损伤治疗与预防中定会进一步发挥重要作用。