东亚地区新生隐球菌菌种复合体种群的遗传多样性特征及其意义

刘益婷 张健烽 王美懿 张宇 陈敏

(1.天津中医药大学研究生院,天津 301600;2.天津市中医药研究院附属医院皮肤科,天津 300131;3.上海长征医院皮肤科,上海市医学真菌分子生物学重点实验室,上海 200003)

新生隐球菌菌种复合体(Cryptococcusneoformansspecies complex,CNSC)是一种重要的致病性担子酵母,是隐球菌感染中最常见的致病菌种[1-2],全世界每年新发隐球菌病有超过80%由其感染所致。既往研究发现,分离自中国等东亚地区的新生隐球菌菌种复合体种群以ST5/VNI型菌株为主,且遗传多样性极低,累及的患者有相当比例免疫功能正常,这种流行病学及群体遗传学特征在全球都是独特的。新生隐球菌菌种复合体主要存在于土壤、桉树等树木以及鸟类粪便中,尤其是鸽粪,与鸟类迁徙有着密切的联系[3]。其主要感染途径为包含孢子或小荚膜菌体的气溶胶被人体吸入,再穿越肺血屏障进入人体循环系统,尤其以肺-淋巴复合体的形式潜伏在人体,在人体免疫功能低下的时候增殖引起播散感染,当穿过宿主血脑屏障引起播散传染,可发展成隐球菌性脑膜脑炎、脑脊髓膜炎等[4]。

近年来,各种新型分子标记技术的研发应用推动了新生隐球菌菌种复合体的进化和群体遗传学研究[5]。二十世纪八十年代开始,利用免疫学方法根据新生隐球菌菌种复合体的多糖荚膜组成的不同,将新生隐球菌菌种复合体分为A血清型、D型血清菌株及其杂合子 AD 血清型菌株;其中A血清型菌株在全球优势分布(>80%),而D血清型菌株则在欧洲地区分布率较高[1, 6];在我国等东亚地区,A血清型菌株也是最主要的致病菌株[3,7-12]。自1990年代起,基因组 DNA 限制性片段长度多态性分析 (restriction fragment length polymorphism, RFLP)、PCR指纹图谱 (PCR fingerprinting)、扩增性片段长度多态性分析 (amplified fragment length polymorphism, AFLP)、多位点序列分析 (multi-locus sequence type, MLST)、全基因组序列分型 (whole genome sequence typing, WGST) 等先后应用于新生隐球菌菌种复合体的分子流行病学及群体遗传学研究,极大地提高了人类在该研究领域的认识水平[13-15]。目前,以噬菌体核心序列M13为单引物的 PCR 指纹图谱技术,可以将全球的 A 血清型菌株划分为 VNI 型、VNII 型和 VNB 型三个分型[16];国际人与动物真菌学学会 (International Society for Human and Animal Mycology, ISHAM) 推荐的MLST技术,可以将VNI 型菌株划分为 ST4、 ST5、ST6、ST31、ST93 等数百种序列(sequence type,ST) 型菌株[17],这也是目前在新生隐球菌菌种复合体分子分型研究中应用最为广泛的技术路线,但基于全基因组序列的WGST分型技术是该研究领域的发展方向。详见图1。

图1 新型分子标记技术推动隐球菌菌种复合体的分类学及群体遗传学的研究Fig.1 Novel molecular marker techniques have advanced the taxonomy and population genetics of Cryptococcus species complex

ST5/VNI型菌株广泛分布于全世界,但其在东亚地区占比极高(>95%)[12,18-23],且不同于全球大多数其他国家,东亚地区的新生隐球菌菌种复合体感染病例中的HIV阴性和免疫功能正常的宿主占比较高[19,24-27],这种特征在全世界都是独特的。因此,系统回顾我国等东亚国家和地区的新生隐球菌菌种复合体的临床与环境分离菌株种群的遗传多样性特征、播散路径、耐药趋势等研究结果,对分离自东亚地区新生隐球菌菌种复合体种群的基因型及交配型分布、群体扩张特征等多个群体遗传学角度进行综述,为提高揭示新生隐球菌菌种复合体感染的精准防治水平在我国等东亚国家进化和种群扩张的模式等群体遗传学特征的研究提供理论科学基础。

1 东亚地区新生隐球菌菌种复合体种群的群体遗传多样性特征

新生隐球菌菌种复合体在全球范围内广泛分布,基于全基因组序列的系统发育学分析提示其起源于非洲[28-29],且不同遗传谱系的菌株在地理分布、毒力及对抗真菌药物的敏感性等方面存在显著差异[30-32]。根据目前已经报道的数据[33],A血清型的ST5/VNI 型菌株(>95%)在东亚地区的分布最占优势,与其他地区有显著不同[1,18,21]。例如2013年,有学者对泰国222株临床分离株进行分析,其中主要以ST4(41.9%;93/222)、ST5(13.5%;30/222)、ST6(37.8%;84/222)为主[19]。2020年,有学者在印度收集296株临床分离株,以及227株环境分离株;对其中105株(91株临床和14株环境分离株)进行分析,所有分离菌株分子分型均属于VNI型;临床株群体中78%(71/91)属于ST93型,环境株中29%(4/14)属于ST93型[34]。分离自中国、日本、韩国等东亚地区的新生隐球菌菌种复合体种群具有相似的遗传多样性特征,与分离自其他亚洲国家如泰国(ST4、ST6/VNI)、印度(ST93/VNI)的新生隐球菌菌种复合体种群基因型结果有显著不同[20,23]。

目前,东亚地区除蒙古国和朝鲜未有新生隐球菌菌种复合体报道外,均有新生隐球菌菌种复合体相关报道,其中以来自中国的报道最多。从2013年至2022年,先后有学者对北京、四川、江西、华东地区等多地进行报道[35-45]。对其统计得出,总共1327株临床株,90.2%(1197/1327)株临床株属于ST5型新生隐球菌菌种复合体,占绝对优势。日本、韩国也有相应报道,经统计,其临床株优势分型菌株也是ST5型,分别占比91.8%(67/73)[19-20]、95.6%(175/183)[12,22]。

例如,2013年有学者对亚洲476份新生隐球菌菌种复合体临床分离株进行研究(228株来自HIV阳性患者),其中属于东亚地区的分别来自中国的上海和香港地区以及日本共138株,其中88.4%(122/138)属于新生隐球菌菌种复合体ST5型[19];2013年,对日本长崎的35株从HIV阴性患者中分离的新生隐球菌菌种复合体进行了分析,91.4%(32/35)为VNI型,3株为VNⅡ型;其中88.6%(31/35)属于ST5型[20];2014年,对分离自韩国首尔地区的46株新生隐球菌菌种复合体临床分离株进行分析,均为VNI型,95.7%(44/46)属于ST5型[12];2015年,对韩国137株新生隐球菌菌种复合体的临床分离株和10株环境分离株进行分析,临床分离株中99.3%(136/137)为VNI型,1株为VNⅣ型;VNI型菌株中96%(131/137)属于ST5;环境分离株中均为VNI型,其中ST5 (n=7),ST31 (n=3)[22];2015年,对北京两所医院的新生隐球菌菌种复合体临床分离株进行分析,27.2%(22/81)来自HIV阳性患者,其中97.5%(79/81)为新生隐球菌菌种复合体 VNI 型,1株VNB型;其中93.8%(76/81)株属于ST5型,其中ST296、ST295菌株是首次在中国报道[35];2015年,对四川地区的新生隐球菌菌种复合体临床分离株进行分析,91株新生隐球菌菌种复合体均为VNI 型,对其中18株进行MLST分析,88.9%(16/18)株属于ST5[36];2016年,对在中国哈尔滨、辽宁、四川等7个地区共收集了303株新生隐球菌菌种复合体临床分离株,96.4%(292/303)属于ST5型,6.3%(19/303)属于ST31型[37];2017年,来自北京地区的新生隐球菌菌种复合体临床和环境分离株研究发现,25株临床分离株中96%(24/25)为VNI型,1株为VNⅢ;88%(22/25)属于ST5型[38];2018年,对江西的86株新生隐球菌菌种复合体临床分离株进行研究,40.7%(35/86)来自于HIV阳性患者,其中84.9%(73/86)属于ST5型,以及7种其他ST型,其中ST319和ST226之前未曾发现[39];2020年,对华东地区的97株新生隐球菌菌种复合体临床分离株进行研究,28.9%(28/97)来自于HIV阳性患者。其中99%(96/97)为VNI型,1株为VNⅣ型;其中92.8%(90/97)属于ST5型[40];2021年,对北京一医院从HIV阳性患者中分离出的74株新生隐球菌菌种复合体进行分析,有65株进行分型,分为 12种ST型,其中78.5%(51/65)属于ST5型[41];2021年,对江西199株新生隐球菌菌种复合体临床分离株进行分析,37.2%(74/199)来自HIV阳性患者,其中89.4%(178/199)属于ST5型[42];2021年,对四川 130株新生隐球菌菌种复合体临床分离株进行了研究,分别为87.7%(114/130)属于ST5,10%(13/130)属于ST31[43];2022年,对华东133新生隐球菌菌种复合体临床分离株进行了研究,45.9%(61/133)来自HIV阳性患者,除了4株未明确分型外,96.2%(128/133)为VNI型,1株为VNⅡ型;其中90.2%(120/133)株为ST5型[44];2022年,对中国台湾南部的109株新生隐球菌菌种复合体临床分离株,并对其中90株进行了MLST分析,98.9%(89/90)为VNI型,1株为VNⅡ型,其中82.3%(79/90)属于ST5型[45]。

综上,东亚各地区(蒙古与朝鲜未见相关报道)的优势ST型如下:在中国,临床株优势ST型为ST5型,占90.2%;但环境株优势ST型为ST31型,占47.2%,ST5型仅占12%。韩国临床株和环境株优势ST型均为ST5型,分别占95.6%和70%。日本临床株优势ST型为ST5型,占91.8%,环境未见报道。

目前学术界普遍认为隐球菌感染的主要途径是吸入源于环境的含孢子或菌体的气溶胶[1-2]。然而,2017 年一项来自中国北京及其周边地区的新生隐球菌菌种复合体环境分离株的研究却发现 ST5 型菌株在该地区的新生隐球菌菌种复合体环境株种群中占比极低 (约 6.2%;5/86),处于优势分布地位的是 ST31 型菌株 (占比约 66.7%;54/81)[38]。针对这一反常现象,2021年,笔者等在长三角地区 11 个城市开展新生隐球菌菌种复合体环境分离菌株的遗传多样性研究,发现处于优势分布地位的仍然是 ST31 型菌株 (约 21.3%;13/61),ST5 型菌株占比约 19.7% (12/61),亦远低于其在临床株种群中的优势分布比例[46]。临床与环境菌株种群的 ST 型分布存在显著的差异,临床株种群以ST5 型为主,环境株种群以 ST31 型为主,这提示ST5 型菌株可能较 ST31 型等其他ST型菌株具有更高的毒力。

2 交配型

新生隐球菌菌种复合体(Cryptococcusneoformansspecies complex,CNSC)属于典型的异宗交配的担子菌酵母,其在自然环境中主要是单倍体交配型α和交配型a细胞之间的交配。交配型的确定可以通过特异性引物对STE20位点的等位基因进行PCR[12];也可以通过新生隐球菌菌种复合体(血清型A)分别与KN99(a)和 KN99(α)在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(yeast peptone dextrose,YPD)上共培养,或新生隐球菌菌种复合体(血清型D)分别与JEC20 (a) 和JEC21 (α)在YPD上共培养[47]。交配型基因位点(mating type,MAT)是目前已鉴定基因位点中最大的一个,超过100 kb[48]。研究发现,我国等东亚国家的新生隐球菌菌种复合体种群菌株绝大多数都是A血清型的α配型菌株 (占比大于 99%),其毒力也强于 a 配型菌株,且更易扩散到中枢神经系统[1,3,47-48]。既往研究表明,临床和环境分离出的新生隐球菌菌种复合体菌株绝大多数都是血清型A(MATα)(超过90%以上)和血清型D(MATα),仅仅极少数的菌株属于AD血清型杂合子菌株,其中血清型AaDα占比相对较多[29,47,49-51]。

3 抗真菌药物的敏感性

近年来,因为临床抗真菌药物的不规范使用以及自然环境中的唑类抗真菌农药的广泛使用,新生隐球菌菌种复合体在全球的耐药率也在不断上升。2016年,有学者对国内多省的野生型菌株和非野生型菌株分别进行了药物敏感性测试,发现野生型菌株对常用抗真菌药物敏感,而非野生型菌株有23株对氟康唑(fluconazole,FLU)的MIC>8 mg/L[37]。2019年,有学者对上海、四川、浙江以及广东的多株儿童感染患者的新生隐球菌菌种复合体进行药物敏感性研究,也有多株新生隐球菌菌种复合体分别对5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)、氟康唑和伊曲康唑(itraconazole,ITR)药物敏感性降低的的报道[52]。近年来,国内有多位学者对新生隐球菌菌种复合体进行药物的敏感性测试,其MIC整体呈上升趋势,其中尤以对氟康唑为明显,详见图2。

图2 近年来,国内新生隐球菌菌种复合体MIC值走向。 #: MIC的几何平均数;*: GM数值为0,是该条文献未给出该值; ▲:该行为MIC值范围Fig.2 In recent years, the MIC value trend of CNSC in China. #: The geometric mean of the MIC; *: The GM value is 0, which is not given in this article; ▲: This line is the MIC value range

4 结 论

总结近10年来全球各地的多项针对隐球菌临床分离菌株的相关研究结果,我们发现以中国为代表的东亚地区国家隐球菌感染有独特的分子流行病学特征,如遗传多样性程度极低,ST5 型/α 配型新生隐球菌菌种复合体菌株在临床分离菌株种群中占绝对优势地位(>95%),其群体扩张模式符合从外界传入后,快速无性克隆性扩增的模式。但也有研究提示即使在克隆性扩增菌株群体内部,也存在无性交配增殖的模式,值得进一步研究。ST5 型新生隐球菌菌种复合体菌株也起源于非洲,虽然在全球分布,但其在东亚地区隐球菌病感染中占比极高,其可能已经完成对我国等东亚国家本土生态龛位环境压力的适应性进化,同时使其获得了较强的毒力及更易侵袭免疫功能正常宿主的能力。此外,由于抗真菌药物的滥用以及农药的推广,新生隐球菌菌种复合体对抗真菌药物,尤其是唑类药物的不敏感或耐药趋势逐渐明显。因此,加强对ST5型等新生隐球菌菌种复合体菌株的起源、种群扩增模式、毒力进化、基因流等群体遗传学及抗真菌药物的敏感性监测研究对提高我国在内的东亚国家隐球菌病防治水平有重要的科学意义。