肺腺癌组织中piR-30636的表达、临床意义及对迁移的影响*

张小丹 王喻烨 严雪冰 王成海

1 扬州大学医学院,江苏省扬州市 225009; 2 东台市中医院

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其复发率和死亡率位居所有恶性肿瘤之首[1-2]。根据形态学特征,肺癌分为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌。NSCLC中最常见类型为肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LUAD)[3]。尽管最近医疗技术取得了较大的进步,但LUAD的5年生存率仍然很低[4-5],主要是因为LUAD在早期缺乏明显的症状,难以检测。因此,迫切需要寻找新的肺癌诊断指标和治疗方法。

PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA,piRNA)是一种非编码小RNA,长度约为30个核苷酸[6]。研究表明,PIRNA和PIWI蛋白在各种癌症中的异常表达可能成为肿瘤诊断和治疗的新生物标志物和治疗靶点[7]。Li等[8]通过人类小RNA表达谱测序分析了五对LUAD组织中piRNA的表达情况,发现piR-30636、piR-26925和piR-5444在LUAD组织中表达显著上调,但文中仅研究了piR-26925和piR-5444作为LUAD诊断的生物学指标,并没有对piR-30636的作用进行相关研究。因此本文通过研究肺腺癌组织中piR-30636的表达、临床意义及对迁移的影响,以便发现LUAD中piR-30636的生物学功能。

1 材料和方法

1.1 样本和资料 选取2020年1月—2022年12月期间,在扬州大学附属医院和东台市中医院接受肺癌手术切除的76例患者作为研究对象,年龄35～68岁,中位年龄52岁。(1)纳入标准:①临床资料、病理资料无缺失者;②经病理医师确诊为肺腺癌患者;③术前未接受放疗、化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗者;④对本研究知情同意者;⑤预期生存时间>3个月;⑥患者具有良好的器官功能。(2)排除标准:①合并其他部位恶性肿瘤者;②合并脑转移;③药物不可控制的高血压[收缩压≥140mmHg(1mmHg=0.133kPa),舒张压≥90mmHg];④心、肝、肾功能不全;⑤自身免疫性疾病、感染性疾病患者;⑥有出血倾向或正接受抗凝治疗者。收集76例配对的LUAD组织和邻近的正常肺组织以及相关病理资料。本实验经扬州大学医学院伦理委员会批准,并与患者签署知情同意书。

1.2 质粒和细胞 piR-30636 mimic和si-piR-30636质粒合成于南京金斯瑞生物科技公司。肺上皮细胞系16HBE和人肺腺癌细胞系A549购自上海中科院细胞库。通过Lipofectamine 2000细胞转染试剂盒将piR-30636 mimic和si-piR-30636质粒转染至A549宫颈癌细胞株,并将细胞株均放置在含10%胎牛血清RPMI 1640培养基的培养瓶中,然后放置在37℃,含有5% CO2浓度细胞培养箱内进行培育。

1.3 实时荧光定量PCR实验 肺腺癌总RNA的抽提是通过TRIZOL试剂裂解萃取并通过分光光度计测定RNA浓度。然后通过Takara公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA。实时荧光定量PCR运用PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒(Takara公司),并按试剂说明书进行。piR-30636的上游引物为AGGUCCUCAGCUCUCAUG,下游引物为AGGACCCCUGUCCUAGGU。将包含反应体系的检测样本在Applied Biosystems 7500 R-T PCR system进行qRT-PCR实验,实验步骤包括:(1)预变性:95℃ 时间为30s。(2)PCR反应:重复:40个循环,95℃ 时间为5s; 60℃ 时间为45s。

1.4 原位杂交检测piR-30636的表达 76例新鲜标本进行组织切片。在室温下,过氧化氢处理可消除内源性过氧化物酶。使用胃蛋白酶消化组织切片。用预杂交液在培养箱中孵育组织切片,然后加入杂交液孵育12h。清洗后加入密封液。加入生物素化地高辛。组织中加入SABC。加入生物素化过氧化物酶。组织进行DAB染色、苏木精复染、洗涤、脱水、透明、封闭。用预杂交液代替含有探针的杂交液作为空白对照,piR-30636寡核苷酸探针序列为:(1)ACCUAGGACAGGUCCUCAGCUCUCAUG,(2)AUGAGAGCUCAGGACCCCUGUCCUAGGU。每个样本取5个高倍视野计算阳性细胞比例:阳性细胞数/总细胞数。

1.5 Transwell迁移实验 首先将细胞在无血清的培养液饥饿12h,胰酶消化后制备无血清培养液重悬细胞(5×105/ml)。取细胞悬液100μl加到Transwell小室中央中,下室加入2.5% FBS 的 600μl培养液,将小室放进37℃、5%CO2培养箱中培养24h。取出Transwell小室, PBS清洗后甲醇固定30min,将Transwell小室适当风干;0.1%结晶紫染色20min左右,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3次;400倍光学显微镜下随即挑选5个视野观察迁移的细胞,并计数穿膜的A549细胞个数并拍照。分组包括过表达piR-30636组、沉默表达piR-30636(si-piR-30636)组和正常A549细胞(NC)组。

1.6 统计学方法 使用SPSS16.0和Graph Pad 5.0软件分析数据和编辑图片。计数资料组间采用Pearson’s法χ2检验,计量资料采用均数±标准差表示,符合正态分布,两组间行t检验,多组间行ANOVA检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LUAD组织中piR-30636的表达 qRT-PCR实验结果如图1所示,在LUAD组中 piR-30636的表达水平为6.975±2.336,明显高于癌旁正常肺组织的表达水平(1.796±0.922),两组间差异有统计学意义(t=22.461,P<0.05)。

图1 qRT-PCR检测piR-30636的表达水平

图2 RISH显示LUAD组织中piR-30636的阳性表达

2.2 RISH检测piR-30636的阳性表达 采用RNA原位分子杂交(RISH)检测76对LUAD组织和癌旁正常肺组织中piR-30636的阳性表达情况。如图2所示,在LUAD组织中piR-30636主要为阳性表达,胞浆着色为棕黄色的是阳性细胞。piR-30636阳性率为72.37%(55/76)明显高于邻近正常组织的15.79%(12/76),两组间有统计学差异(χ2=5.441,P=0.020<0.05)。

2.3 piR-30636阳性表达及其临床病理意义 根据piR-30636的阳性表达情况,将LUAD病例分为阳性表达组55例和阴性表达组21例。如表1所示, piR-30636阳性表达与肿瘤分级、淋巴结转移密切相关(P<0.05),而与患者的年龄、性别、吸烟、肿瘤大小、TNM分期无关(均P>0.05)。提示piR-30636参与了肺腺癌的淋巴结转移过程。

表1 piR-30636阳性表达及其临床病理意义

2.4 Transwell实验检测piR-30636对肺癌细胞迁移的影响 上述临床病理意义结果表明piR-30636与LUAD的淋巴结转移密切相关,因此通过Transwell实验进一步研究piR-30636对肺癌细胞迁移的影响。首先验证过表达或沉默piR-30636表达的有效性:应用Lipofectamine 2000转染实验,将过表达或沉默piR-30636表达的质粒载体转染A549细胞。结果发现过表达piR-30636后,piR-30636的表达水平升高,而沉默表达piR-30636后piR-30636的表达水平降低(如图3所示)。与未转染相关质粒的对照组(NC)相比,两组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。说明过表达和沉默piR-30636表达的质粒有效。

图3 在A549中过表达或沉默piR-30636的有效性分析结果

然后进行Transwell迁移实验,结果如图4所示,piR-30636的过表达显著促进了肺癌细胞株A549的迁移,而沉默表达piR-30636则明显阻碍了A549的迁移,与对照组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。实验结果表明piR-30636对肺癌细胞的迁移作用。

图4 Transwell检测piR-30636对肺癌细胞的迁移结果

3 讨论

目前在中国,肺癌的发病率已排在恶性肿瘤的首位,每年发病人数约78.1万,死亡人数也达到62.6万左右[9],患者死亡的主要原因在于肺癌的转移、复发和耐药性。近年来随着临床治疗方案的不断改进,越来越多的靶向药物和新的生物免疫疗法的综合应用,肺癌患者的生存和预后得到了明显的提高和改善[10]。

与PIWI蛋白相作用的非编码单链小RNA称为piRNAs,其生物学功能包括沉默转录基因过程、维持生殖系和干细胞功能,调节翻译和mRNA的稳定性等[11]。目前piRNA已成为恶性肿瘤研究的热点之一[12]。例如,在非小细胞肺癌中piR-651表达水平上调,能促进肺癌细胞的迁移、侵袭和转移[13]。Peng等[14]检测发现肺癌组织中piR-55490的表达水平下调,能促进肺癌细胞凋亡而抑制细胞增殖,具有抑癌基因的作用。piR-1366在NSCLC中表达水平升高,是一个新的促癌基因,能促进肺癌淋巴结的转移[15]。本文通过qRT-PCR实验发现在76例LUAD组织中piR-30636的表达上调,验证了piR-30636在表达谱测序的结果[8],这也说明了piR-30636是一个致癌基因。本文以piR-30636作为研究对象,研究其在LUAD生物学作用。

RISH显示LUAD组织中piR-30636 主要呈阳性表达,而正常肺组织中主要为阴性表达。实验结果进一步表明piR-30636在LUAD中表达上调,发挥促癌基因的作用。在分析piR-30636不同的阳性表达水平与临床资料的关系时发现piR-30636的阳性表达与LUAD的肿瘤分级和淋巴结转移密切相关,该结果说明piR-30636表达水平越高则肿瘤越容易发生淋巴结转移,piR-30636可作为判断患者预后的一个指标。为了进一步证明piR-30636对LUAD肺癌细胞转移的影响,我们进行了Transwell迁移实验。本研究表明piR-30636的过表达显著促进了肺腺癌A549细胞的迁移,降低piR-30636表达则明显阻碍了A549的迁移;该结果表明piR-30636能促进肺腺癌细胞的迁移和远处转移,也为 piR-30636作为靶点治疗转移性肺腺癌提供依据。本研究不足之处在于目前只研究了piR-30636在肺腺癌中的功能,并没有对促转移作用机制进行探究。

总之,本文认为piR-30636与肺腺癌的生物学行为有一定的相关性。piR-30636在肺腺癌组织中表达水平上调,是一个新的促癌基因;高表达的piR-30636与肿瘤淋巴结转移有相关性,piR-30636有促进肺癌细胞迁移作用,本次实验为进一步研究肺腺癌伴有淋巴结转移机制提供了一定的理论依据,piR-30636有可能成为治疗转移性肺腺癌的新靶点。