银鼓鱼肠道病原菌分离鉴定及药敏试验

陈攀，刘龙勋，沈华建，刘豫皖，林晨洁，黄海*

（1.海南热带海洋学院水产与生命学院，海南省热带海洋渔业资源保护与利用重点实验室，海南 三亚 572022；2.海南热带海洋学院海洋科学技术学院，海南 三亚 572022）

银鼓鱼（Selenotoca multifasciata），又名多纹钱蝶鱼，隶属于鲈形目（Perciformes）、金钱鱼科（Scatophagidae）、钱蝶鱼属（Selenotoca），广泛分布于印度尼西亚、泰国、大洋洲及我国东海南部至南海和北部湾的沿海、河口地区。其体表有多个黑色圆点，体色呈亮白色，兼具观赏和食用价值。该鱼具有生长速度快、广盐、广温、可进行混养和密养等特点，养殖前景广阔，深受养殖户欢迎[1]。但随着养殖规模的不断扩大、养殖密度的不断提高以及养殖环境的恶化等，银鼓鱼的病害日趋频发。车轮虫（Trichodina）病、淀粉卵甲藻（Amyloodinium ocellatum）病、吸虫（Trematoda）病、海豚链球菌（Streptococcus iniae）病等，均对其养殖造成了严重的危害[2-4]。

2021 年7 月，在海南陵水养殖基地发现银鼓鱼出现疑似肠道炎症，为了解银鼓鱼的致病原因，采集了患病银鼓鱼样本，对其进行了病原菌的分离、鉴定及药敏试验，旨在为该疾病的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鱼来自海南陵水德林诚信水产养殖有限公司。采集3 尾发病鱼，平均体质量为（75.1±2.2）g，平均体长为（21.1±0.47）cm。人工回归感染试验用鱼共约200 尾，平均体质量为（55.2±8.9）g，平均体长为（15.3±1.4）cm。带回实验室暂养于养殖桶中，水温为24～26 ℃，持续供氧，每天换1/3 水，暂养2 周。

1.2 试剂和仪器

AI6058027 桌面式超净台（苏净安泰有限公司）、DYY-8C 电泳仪（北京六一仪器厂）、革兰染色液（北京酷来搏科技有限公司）、生理生化鉴定盒（广东环凯生物科技有限公司）、牛肉浸膏（北京索莱宝科技有限公司）、胰蛋白胨（北京索莱宝科技有限公司）、琼脂粉（北京索莱宝科技有限公司）、药敏纸片（上海源叶生物科技有限公司）、TCBS 培养基（青岛高科技工业园淄博生物技术有限公司）、酵母浸膏（北京索莱宝科技有限公司）、比浊管（比克曼生物科技有限公司）、磁珠菌种保存管（青岛高科技工业园淄博生物技术有限公司）、细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）、琼脂糖（太阳马）。

1.3 病原菌的分离和纯化

将发病鱼置于超净工作台，先对鱼体消毒，然后用接种环在病灶组织中接菌，随后划线于普通肉汤营养固体培养基和TCBS 固体培养基上，倒置培养24 h 后，观察菌落生长情况；之后挑单菌落置于LB 液体培养基，振荡培养24 h 后，吸取菌液约0.2 mL 进行平板涂布；随后，挑取获得的单菌落，用固体培养基进行划线培养，并保存于4 ℃冰箱中，供长期试验；其余挑取部分单菌落，使用磁珠菌种保存管，置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 人工回归感染试验

将菌株重新活化置于人工气候箱培养，然后从活化后的平板挑取单菌落，扩大培养24 h 后，将所获得的菌液于5 000 r/min 离心3 min 后，倒掉培养基，留下菌液沉淀，再倒入无菌生理盐水，重复以上步骤进行第2 次离心。离心结束后，参照麦氏比浊法进行调整，将菌液浓度调整为1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5×103cfu/mL。从养殖桶中随机选取180 尾健康活跃的银鼓鱼，放养于49 cm×34 cm×30 cm 水族箱中，每箱10 尾，持续供氧，暂养12 h。感染试验共分成6 组，5 组感染和1 组对照，每组3 个重复。采用腹腔注射法，感染组每尾注射0.2 mL 菌悬液，对照组每尾注射0.2 mL 灭菌生理盐水。在感染期间，每日换水1/3，正常投喂饵料，并进行日常残饵和粪便清理，随时观察记录银鼓鱼发病情况，将濒死的病鱼进行解剖，观察其病理症状并记录。随后用接种环挑取鱼体内明显病变组织，划线培养于TCBS，并与感染菌株进行对比，对菌株初步鉴定。

1.5 病原菌鉴定

1.5.1 形态学观察

将1.3 中分离纯化的菌株置于29 ℃人工气候箱恒温培养，待长成菌落后，观察记录菌落形态、干湿度、透明度、颜色、边缘、直径以及液体培养基生长情况等。随后在超净工作台上挑取些许菌落进行革兰染色镜检，观察病原菌染色结果及菌体形态特征。

1.5.2 病原菌生理生化试验

将固体培养基上的菌株接种进行液体培养，然后根据生化反应管操作说明书，分别接种至细菌生理生化微量鉴定管中进行测定，随后放置于29 ℃人工气候箱中，培养24 h，按照生化反应管说明书及《第八版伯杰氏细菌鉴定手册》比对结果，并记录。

1.5.3 16SrRNA 片段扩增及序列分析

在超净工作台中，从活化后的平板上挑取单菌落，采用细菌基因组提取试剂盒，提取菌株基因组DNA，提取步骤按照说明书。随后以细菌16S rRNA基因的通用引物作为引物（表1），以1 μL DNA 为模板进行扩增。PCR 扩增反应如下：95 ℃5 min；96 ℃20 s；62 ℃20 s；72 ℃30 s，循环35 次；72 ℃再延伸10 min。随后将3 μL PCR 产物进行1.0%的琼脂糖凝胶检测，观察条带大小。产物纯化根据磁珠纯化标准步骤，然后将纯化后的产物送至六合华大基因科技有限公司测序，将所获得序列结果于NCBI进行blast 比较，利用Mega7.0 采用邻接法进行菌株的系统发育树的构建。

表1 引物信息

1.6 病原菌生长

用接种环挑取活化后的单菌落置于LB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min 恒温摇床振荡培养。采用紫外分光光度计，测量菌液各时间段的吸光度值（OD），同时设置空白对照，最后以吸光度值作为纵坐标，生长时间作为横坐标，绘制菌株生长曲线。

1.7 药敏试验

将菌株进行划线培养12 h，然后再从平板中取单菌落进行液体培养，培养至菌株生长对数期，随后，取样制备菌悬液，用移液枪吸取0.2 mL 置于平板中央，用涂布器将菌液以逆时针方向进行涂布展开，然后将选择好的药敏片黏贴在含菌液的培养基表面，倒置培养1～2 d，随后取出测量其形成的抑菌圈的直径，并根据抑菌范围判断菌株对各类药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 病鱼症状

患病鱼体色正常，体表零星分布出血点，主要集中在背鳍、臀鳍和尾鳍基部。腹腔积水呈黄色；肝脏肿大，部分糜烂；胆囊颜色加深且肿胀；脾脏红肿；肾脏暗红；肠壁充血、弹性差，具有明显炎症且带有白便，见图1（a）（b）。

2.2 病原菌分离纯化及形态学观察

从病鱼肠道中分离出1 种优势病原菌株。划线培养1 d 后观察菌落，结果显示，菌落呈黄白色，卵圆、湿润、不透明，菌落边缘锯齿状，直径约1～2 mm，具一定运动性，在液体培养基上呈浑浊生长。菌体似杆状，革兰染色阴性，TCBS 显黄色，见图2（a）（b）（c）（d）。

图2 菌株形态观察

2.3 人工回归感染试验

试验组注射后，在1～2 d，个别鱼出现游泳迟钝、偶尔沉底、有明显溜边现象，与对照组相比，鱼体色明显暗淡；3～4 d，试验鱼变得更加不活跃，身体翻转、动作迟钝，喜趴于气石附近不动，进食缓慢，无食欲，个别鱼出现亢奋不安，不停探头；5～8 d，试验鱼大都出现沉底、翻边等异常行为，有些鱼出现胀腹现象，濒死的鱼除了鳍部有少量充血，其余无明显变化；9～11 d，出现上下游动频繁、上下打圈游动、食欲较差现象；12～14 d，多数鱼出现不游的情况，偶尔出现鱼体侧面与缸底平行游动倒翻沉底的现象，至14 d 累计死亡率为30.0%～66.6%。对照组无死亡。采用寇氏法计算出病原菌的半致死浓度为2.18×106cfu/mL，见图3。

图3 分离菌株感染银鼓鱼的试验结果

通过对每日濒死鱼体进行解剖观察，发现其症状基本一致，主要集中表现为鳃呈暗红色，肝、肾脏红肿，有部分糜烂，脾脏发肿，肠道扩张且肠道内有淡黄色液体，肠壁上略微充血，胆囊肿大且颜色加深，见图4（a）（b）（c）（d）。这些发病症状与原发病症基本一致。从病灶部位处接菌划线培养于TCBS，其与初次分离的菌株在形态和特征方面基本一致。

图4 回归感染银鼓鱼症状

2.4 病原菌的鉴定

2.4.1 生理生化试验

对照细菌生理生化试剂盒中的参考标准，分离菌对水杨素、蔗糖、精氨酸脱羧酶呈阳性且液化明胶，而对于蛋白胨水、赖氨酸脱羧酶和葡萄糖呈阴性（表2）。查阅《第八版伯杰氏细菌鉴定手册》，发现分离菌与肠弧菌属的生理生化特性类似，初步认定该菌株为肠弧菌属。

表2 生理生化的反应结果①

2.4.2 16SrRNA 片段扩增及序列分析

提取分离菌株DNA，进行电泳检测。结果显示，菌株条带清晰明亮，表明了试验过程中所提取菌株质量较好（图5）。对经PCR 扩增后的序列进行测序，得到基因序列片段长度为1 405 bp，随后采用NCBI网站中的blast 程序，对序列进行亲缘关系进行比对，结果表明，分离菌与黑肠弧菌（Enterovibrio nigricans）HG326496.1 的16S rRNA 基因序列相似性为99.0%，菌株序列同源性＞99%的都是黑肠弧菌，序列号为JEMV1X63013。利用Mega7.0 软件扩增序列构建系统发育树，结果显示，分离菌与黑肠弧菌HG326496.1 聚类处于同一进化分支，并且与黑肠弧菌（MZ474660.1、MN785681.1、MN7856741.1、MN7856771.1）亲缘关系较近（图6），因此可确认此次分离菌株为黑肠弧菌。

图5 分离菌琼脂糖电泳图

图6 分离菌株系统发育树

2.5 分离菌生长

将分离菌株连续培养9 h，结果表明，菌株自1 h就开始对数生长，2.5 h 对数期结束，并于3～6 h 内处于稳定期，6～9 h 内菌株则处在衰亡期（图7）。

图7 分离菌生长曲线

2.6 药敏试验

21 种抗生素对分离病菌药敏试验结果表明（表3），菌珠对派啦西林、头孢派酮、强力霉素、链霉素、万古霉素、庆大霉素、氟苯尼考、环丙沙星、米诺环素、卡那霉素、四环素高度敏感，而对于诺氟沙星、羧苄西林、苯唑西林、复方新诺明、头孢克肟、头孢吡肟、氨苄西林、青霉素、头孢呋辛和甲氧苄氨嘧啶表现为不敏感。

表3 菌株对药物的敏感性①

3 讨论

鱼类肠炎病是养殖过程中发生频率及死亡率均较高的疾病，伴有发病速度快、病程短等特点，时常对养殖企业造成较为严重的经济损失[5]。目前，较多文献报道显示，导致鱼类患肠炎病的致病病原主要为肠型点状气单胞菌、发光致病杆菌、霍乱弧菌、鲨鱼弧菌、哈维氏弧菌，副溶血弧菌、肠道黏孢子等[6-11]。主要表现为食欲不振或不进食、精神萎靡不振、活动异常、体质减弱。解剖后发现，各脏器均有不同程度出血和充血，肠管出血较为明显并伴有明显的炎症，后肠充满黄色黏液，肝脏出现明显病变。本试验从患病银鼓鱼肠道内分离出致病菌，通过形态学、生理生化和16SrRNA 序列分析方法，确认该菌为黑肠弧菌。人工回感试验表明，黑肠弧菌可导致健康银鼓鱼发病死亡。病理解剖发现，其感染症状与原发病症极为相似，表现为肝、肾脏红肿，肠壁上充血等症状，与刘德建等[12]和杨移斌[13]所描述的鱼体肠道炎症相似，确认该菌可导致鱼体肠道发炎。且其他的病理症状除了与原发病症相似外，也与陈翠珍等[14]从牙鲆肠道中分离出弧菌感染病症类似。至14 d 累积死亡率为30.0%～66.6%，初步判断其具有一定致病力。

黑肠弧菌（E. nigricans），隶属于肠弧菌属，目前关于该菌的国内外报道较少，主要集中在该菌分类地位[15-18]。Pascual 等[15]指出，黑肠弧菌在系统发育上与卡尔文弧菌属有亲缘关系。目前国内外未见黑肠弧菌在鱼类感染致病方面的报道。本试验首次发现黑肠弧菌可引发银鼓鱼肠炎病，初步确认其为导致原发病症的主要致病菌。

为筛选黑肠弧菌的敏感药物，方便相应养殖企业进行施药治疗。本试验采用K-B 纸片扩散法进行药敏试验，发现其对派啦西林、头孢派酮等11 种抗生素高度敏感，而对诺氟沙星等10 种抗生素不敏感。根据药物敏感程度和养殖企业的使用成本，建议使用氟苯尼考和派啦西林对银鼓鱼肠炎进行治疗。此外中草药在治疗肠炎病方面应用普遍且效果较好，如黄柏、黄芩、黄连、五倍子、槐花、穿心莲、大蒜素、松枝叶、菖蒲、板蓝根和大黄等[19-22]。中草药具有低毒、无害、不易产生耐药性等优点[23]，并且施用方便，深受广大养殖户的喜爱。在治疗时，也需注意给药剂量。一般鱼类在出现肠道发炎时，其摄食量会大大降低，如果按照单位饵料质量计算用药量，极易导致内服药投喂量不足，造成治疗效果较差[24]。因而需根据发病鱼的体质量来确定给药量，再依据其日摄食量多少，制成药饵投喂。总之，在疾病的防治过程中，对于药物的选择和施用量方面，要依据“三效”（高效、速效、长效）、“三小”（毒性小、副作用小、剂量小）和“无三致“（无致畸、无致癌、无致突变）的原则，保证药物的使用绿色高效，促进健康养殖。