过硫酸氢钾复合盐粉对水产病原菌的杀灭效果

孙文博，章志强，李庆，曹杨洋，张高峰，杨辉*

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.江苏永荣生物科技有限公司，江苏 连云港 222062）

细菌性疾病一直是制约水产养殖业发展的重要因素[1]，不仅导致水产动物大量死亡，还会引发病毒性疾病暴发，对水产养殖业造成巨大威胁[2]。控制水产养殖环境中病原菌的数量，对于水产动物疫病防控至关重要。目前，水产动物病害防控的关键技术体系包括病原检测、微生态制剂施用、水产消毒剂、中草药和抗生素的应用[3]。其中，化学类消毒剂可以抑制或杀灭水体中的病原微生物，降低水体中病原菌的丰度，在阻止细菌性疾病的传播和暴发方面，发挥着重要作用[4]。由于成本较低且效果显著，化学类消毒剂目前在水产养殖中得到广泛应用。水产养殖中化学类消毒剂的使用缺乏科学指导，滥用消毒剂会给养殖水环境带来危机。因此，研发环境友好型的水产养殖消毒剂，并科学指导其应用，对于水产养殖业的发展，具有重要意义。

过硫酸氢钾复合盐粉（2KHSO5·K2SO4·KHSO4，简称PMS），是一种由单过硫酸氢钾（KHSO5,PMPS）、硫酸氢钾（KHSO4）和硫酸钾（K2SO4）为主，辅以表面活性剂、无机酸和有机酸等组合而成的一种新型的过氧化物类消毒剂。PMS 能够溶于水，分解产物为无害的无机盐，并在水体中产生高活性的自由基和活性氧等物质，通过氧化作用有效杀灭各种病原微生物，具有广谱的杀菌作用、高安全性和环境友好等优点[5]。PMS 还能降解养殖水体中的氨氮，提高溶解氧水平，促进污泥颗粒的分解，从而改善水质和底质[6-7]。目前PMS 已广泛应用于水产养殖、畜牧业、污水处理和医疗环境消毒等领域。然而关于PMS 对水产养殖相关病原细菌的杀灭效果尚不明确，而且不同生产厂家的产品质量也存在差异，使得选择高质量产品变得困难。现选取水产养殖中常见的8 种病原细菌为试验菌株，分析PMS 在不同浓度下的杀菌动力学参数，同时比较了某国产品牌和某进口品牌生产商生产PMS的杀菌效果，为实际生产中的合理使用及后续研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 时间与地点

2023 年4—7 月。试验地位于江苏省扬州大学动物科学与技术学院水产养殖实验室。

1.2 材料

某国产品牌（A 产品）和某进口品牌（B 产品）生产商生产的PMS（以下简称A-PMS、B-PMS）均为50%粉剂（含有50%的PMS）。8 种病原细菌为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）（ATCC 35622）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）（BNCC186123）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）（BNCC133264）、河流弧菌（Vibrio fluvialis）（BNCC337051）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）（ATCC33787）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）（BNCC138541）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum）（BNCC354817）和杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）（CCTCC208068），均为商品化的标准菌株。其中维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠埃希氏菌、河流弧菌、杀鱼爱德华氏菌、溶藻弧菌和鳗弧菌使用LB 液体培养基进行培养，副溶血弧菌使用2216E 培养基进行培养。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌培养及抑菌试验

各菌珠经LB 平板或2216E 琼脂培养基活化后，挑选单克隆菌株，接种于200 mL 相应液体培养基中，并将其放置于恒温摇床（28 ℃/37 ℃，180 r/min）中连续培养24 h 以上，6 000 r/min 离心5 min，收集菌体，并用无菌PBS 磷酸盐缓冲液洗涤2～3 次，做成菌悬液待用。将50%A-PMS 粉剂溶解于无菌水中，并分别配置成1，10，50，100 和200 mg/L的浓度。将配置好的PMS 溶液取10 μL，分别加入1 mL稀释后的8 种菌液中，稀释100 倍，使得PMS 的终浓度分别为0，0.01，0.10，0.50，1.00 和2.00 mg/L。对细菌悬液计数，并进行稀释，确保菌悬液中细菌菌落数少于2×104cfu/mL，以避免菌落数太多致无法准确计数。将不同浓度的PMS与菌液摇匀后，室温下静置处理，并分别在0.5，1.0，1.5 和2.0 h 时，取100 μL 混合液涂布在LB或2216E 营养琼脂平板上，倒置放于28 ℃恒温培养箱培养24 h。培养结束后对平板上的菌落进行计数。

1.3.2 A-PMS、B-PMS 杀菌效果比对试验

将A-PMS、B-PMS 粉剂稀释至终浓度为0.5，1.0，10.0 和50.0 mg/L。所选用的菌株与培养处理的方法同1.2，但仅在处理2 h 时进行涂板计数，计算其杀菌效率。

1.3.3 PMS 对降低鲫感染维氏气单胞菌的死亡率试验

为了进一步验证PMS 对养殖水体病原细菌的杀灭作用，分析PMS 对通过人工浸泡感染维氏气单胞菌鲫死亡率的影响。选择的鲫体质量为（0.52±0.18）g，体长（3.44±0.37）cm。试验鱼暂养在5 L 的透明亚克力水槽中，连续曝气，控温在25 ℃，每个水槽中暂养30 尾鲫，共6 个水槽。感染试验分为2 组，分别为对照组和试验组，每组3 个重复。试验组和对照组的养殖水体中均添加过夜培养的维氏气单胞菌，浸泡感染的细菌浓度控制在106～107cfu/mL。试验组每天往水体中添加A-PMS 至2 mg/L，试验持续5 d，统计鲫的累计死亡率。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0 软件作图，试验数据以“平均值±标准差”表示，采用t检验和单因素方差分析组间数据的差异性，试验组与对照组P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 PMS 对不同病原菌的杀灭效果

PMS 对8 种不同病原菌的杀灭效果见表1。由表1 可见，PMS 对常见菌的杀菌效果不具有特异性。在相同处理时间下，PMS 的浓度越高，菌落数量越少，杀菌率越高。在2 mg/L 的浓度下，处理时间超过1.5 h，杀菌率基本可以达到100%。

表1 不同浓度的PMS 2 h 内对各细菌的杀菌率%

2.2 A-PMS、B-PMS 杀菌效果对比

A-PMS、B-PMS 对8 种不同病原菌的杀灭效果见表2。由表2 可见，在高浓度（5.0 mg/L）下，这2 种产品对所选的8 种常见病原菌都表现出良好的杀菌活性，几乎能完全杀灭该浓度下的病原菌。在低浓度（0.5 和1.0 mg/L）下，A-PMS 对维氏气单胞菌（A. veronii）、嗜水气单胞菌（A. hydrophila）、大肠杆菌（E. coli）、河流弧菌（V. fluvialis）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、杀鱼爱德华菌（E. piscicida）和副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）表现出更高效的杀菌活性。这一结果间接证明了不同厂家生产的PMS 产品之间的差异性，A-PMS 则展现出更好的杀菌效果。

表2 不同浓度的2 种品牌产品对细菌的杀菌率%

2.3 PMS 对鲫感染维氏气单胞菌的累计存活率

采用累计生存曲线，统计了A-PMS对鲫感染维氏气单胞菌的累计存活率，结果见图1。由图1 可见，对照组鲫感染细菌后的存活率，显著降低，经过5 d，累计存活率仅为43%；而试验组在水体中使用2 mg/L 的A-PMS 进行消杀，5 d 后的累计存活率为76%。由累计存活率曲线可见，使用A-PMS 处理养殖水体后，能够显著提高鲫感染维氏气单胞菌的累计存活率。

图1 PMS 对鲫感染维氏气单胞菌累计存活率

3 讨论

3.1 PMS 在水产养殖中的强效杀菌机理及影响因素

PMS 具有强大且有效的非氯氧化能力，为应用广泛的畜禽和水产养殖的消毒剂和水质改良剂[8-9]。作为化学类消毒剂，PMS 的杀菌原理主要是利用其强氧化性，在直接与菌体或酶蛋白中的氨基、羧基、巯基等发生反应的过程中损伤细菌细胞结构或抑制代谢功能，从而导致其死亡[10]。研究指出，PMS的消杀活性受养殖水体中有机物浓度、温度和pH值的影响[11]。除了杀灭细菌外，PMS 还能氧化水体中的有机物，因此也会影响对病原细菌的消杀效果。因此，在评估PMS 对病原菌的杀灭活性时，传统的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定方法不适用，需要采用类似于本试验中分析PMS 对不同细菌的杀菌动力学参数的方法[12-13]。尽管本试验中PMS 对不同病原菌的杀灭效率存在一定差异，但随着PMS 浓度的增加和处理时间的延长，2 mg/L 的PMS 处理2 h，已经能够显著杀灭104cfu/mL 的病原细菌，表现出较强的杀菌效果。PMS 的杀菌效果与浓度、处理时间以及初始菌体数量显著相关，但其对不同细菌的杀灭特异性则不明显。有研究[14]指出，10～60 mg/L 的PMS，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等不同病原微生物处理5 min，其杀灭率均＞99%。1 250 mg/L 的PMS 对溶血性链球菌和多杀性巴氏杆菌作用2.5 min，杀菌对数值＞5[15]。PMS 对黄颡鱼2 种病原菌温和气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌的杀菌浓度分别在31.25 和125.00 mg/L[16]。上述研究表明,PMS 能够显著杀灭病原菌，而杀菌效果差异,主要与PMS 的来源和检测方法有关。而本试验中，排除了培养基中蛋白胨和酵母粉等有机物的干扰，直接展示了PMS 对病原菌的杀灭效果，其结果更能准确反映PMS 对水产病原菌的直接杀灭活性。本试验所选的8 种病原菌均为水产常见致病菌，PMS 对其杀灭效果，为水产养殖病害防控提供了更有效的参考依据。

3.2 PMS 在水产养殖中的效果与安全性

目前市场上销售的PMS 主要以过硫酸氢钾复合盐为主要成分，同时添加了络合剂、增效剂、稳定剂、表面活性剂、氯化钠、有机酸等辅料进行配制。由于不同厂家的配方、生产工艺和原材料等因素的差异，生产出的PMS 产生的效果各不相同，质量良莠不齐[17]。在本试验中，2 种PMS 产品在高浓度下对病原细菌的杀灭效果一致，但在低浓度下，A-PMS 表现出更高的杀菌效率，这也证实了市面上PMS 产品效果的差异性。文献[18]研究指出，1 kg 体质量小鼠，急性经口毒性半数致死量（LD50）＞4 207 mg。在对黄颡鱼使用PMS 毒性研究[19]中，PMS 使用的安全浓度为8.5 mg/L。PMS 对养殖动物的毒性研究相对较少。文献[20]研究表明，水体中投加PMS 消毒后，造成的遗传毒性显著低于次氯酸钠消毒，产生的卤代烃和卤代物生成较少，这也表明PMS 用于消毒仍有一定的安全风险。而本试验中，PMS 显著提高了鲫感染维氏气单胞菌后的累计存活率，并未表现出明显的药物毒性，这说明PMS 是一种有效的预防和治疗水产细菌性疾病的药物。