纳米银在南美白对虾养殖中的应用研究

孟耀文，黄国强*，吴若宁，陆洁，苏兴，钟声平

（1.广西中医药大学海洋药物研究院，广西 南宁 530200；2.防城港市金沙科技有限责任公司，广西 防城港 538000；3.广西海洋环境监测中心站，广西 北海 536000）

文献[1]研究表明，无特定病原（SPF）或特定抗病性（SPR）虾苗有利于养殖成功，但仍不能完全避免疾病的流行。对虾病害的病原种类较多，传播途径复杂且易于引入和繁殖，而SPF 或SPR针对的病原数量较少。对虾病毒性疾病无法治疗，只能预防。近年来，对虾养殖技术系统的开发设计主要围绕其病害预防。但这些系统一般只是杀灭虾池水体中的病原，较难实现对病原的全面杀灭。同时，由于对虾病害病原的复杂性，很多细菌如弧菌（Vibrion），也易引起暴发性疾病。随着食品安全要求的提高，很多药物已经被禁止用于水产养殖动物疾病防治。因此，迫切需要开发无公害水产药物。

纳米银（AgNPs），是采用纳米技术合成的粒径在l～100 nm 的金属银单质。经纳米化处理的抑菌材料，较大的比表面积和小尺寸效应，极大提高了对细菌表面的吸附性和渗透性，杀菌作用比普通银提高了数百倍[2]。纳米材料广泛用于预防水产养殖动物的病害。如马尾藻多糖脂质体纳米制剂，对南美白对虾（Litopenaeus Vannamei）有免疫促进作用，可提高其对白斑病毒和桃拉病毒的抗病力[3]。用山楂提取物合成的纳米银，对鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及点状气单胞菌等4 种典型的水产病原菌，有显著的抑制和杀灭作用[2]，采用银杏叶绿色合成纳米银，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、水产病原菌迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌均有很好的抑菌作用[4]，纳米银对哈维氏弧菌有很好的抑制作用[5]。因此，纳米银具有抗菌谱广、抗菌性强、生物安全性高、不易产生耐药性等优点，作为水产动物疾病防控的药物，具有明显优势，并已经有商业产品供应。

目前，关于纳米银在对虾养殖中的生物安全性和环境安全性，尚未见系统报道。现对商业纳米银产品在南美白对虾养殖中的急性毒性、对弧菌类的杀灭和抑制作用，以及可能导致的水环境和养殖产品银累积进行研究。

1 材料与方法

1.1 时间与地点

2022 年8 月至12 月。试验地位于广西海洋研究所有限公司。

1.2 材料

预试验采用容积为2 L 的6 个塑料小桶，正式试验采用18 个容积为10 L 的塑料养殖箱。试验使用的纳米银是由广西防城港市金沙海洋科技有限公司生产的“金沙纳米银”商业纳米银产品（液态）。

1.3 毒性试验

1.3.1 预试验

6 个塑料小桶均加入海水1 L，然后每个桶依次加入浓度为0，0.5，5.0，50.0，500.0 和5 000.0 mL/m3的纳米银，持续充气10 min，使纳米银和水体混合均匀，每个桶放入10 尾全长0.7～0.8 cm 的虾苗后开始计时，在24，48 和96 h 时，检查各桶虾苗的存活情况。试验水温28 ℃，盐度2.5%。96 h 时，ρ（纳米银）＜50.0 mL/m3的桶没有虾苗死亡，＞500.0 mL/m3的桶有虾苗死亡。由此判断，纳米银对虾苗的急性毒性可能较低，引起虾苗死亡的最低浓度为50.0～500.0 mL/m3，要设置较大的浓度范围，才能使虾苗的死亡率从较低水平达到90%以上。

1.3.2 正式试验

在预试验的基础上，设置推荐浓度（0.5 mL/m3）0，500，1 000，2 000，4 000 和8 000 倍6 个浓度，每个浓度3 个重复。其余试验条件与预试验一致。18 个养殖箱均加满海水，每3 个箱加1 种浓度的纳米银充气10 min 混匀后，各箱均放入100 尾活力好的虾苗，开始计时，在24，48 和96 h 时检查对虾死亡情况。对死亡率与纳米银药物浓度进行回归分析，并根据回归关系计算半致死浓度（LC50）。

1.4 样品采集

1.4.1 水体

以纯净水为对照，采集周边天然海水、周边养殖虾池水样和试验养殖虾池水样，每类样品都采集15 份，分别根据弧菌培养和银含量测定要求，进行处理和保存。

1.4.2 南美白对虾

养殖试验为分段式养殖，于2022 年8—11 月，在广西精工海洋科技有限竹林盐场基地进行。设置5 个初始养殖密度，分别为D1（100 ind/m2）、D2（400 ind/m2）、D3（900 ind/m2）、D4（1 600 ind/m2）、D5（2 500 ind/m2）。养殖期间，每隔10 d，将0.5 mL/m3纳米银加水混匀后泼洒到养殖池。试验结束时，采集虾样品，每个处理各15 尾；养殖期间，收集基地周边养殖池塘养殖虾样品6 份（每份15 尾），竹林盐场临近海区捕捞的长毛对虾（Penaeus penicillatus, P.P）、宽沟对虾（Penaeus latisulcatus, P.L）、周氏新对虾（Metapenaeus joyneri, M.J）、墨吉对虾（Fenneropenaeus merguiensis, F.M）样品各30 尾，以及超市出售的虾皮—中国毛虾（Acetes chinensis,A.C）500 g，按弧菌培养和银含量测定要求进行处理和保存。

1.5 弧菌密度检测

弧菌检测，使用常德比克曼生物科技有限公司生产的水产弧菌检测试剂盒培养计数。基本操作顺序如下：用移液枪取1 mL 水体，涂布到每个平板上，36 ℃恒温摇床中培养24 h 后，用放大镜对菌落进行计数。将对虾称质量后，按体质量1∶9 比例加入生理盐水，匀浆后静置10 min，取1 mL 上清液涂布到每个平板上，36 ℃恒温摇床中培养24 h 后，用放大镜对菌落进行计数。计数的弧菌为副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、河弧菌（Vibrio fluvialis），4 种弧菌数相加得到总弧菌数。

1.6 银浓度检测

水样和虾体的银浓度，用单四极杆电感耦合等离子体质谱仪（SQ-ICP-MS）（赛默飞世尔）测定。水样直接测定；将对虾样品烘干、粉碎后，过孔径为0.178 mm 筛网，经消解后取消解液测定。

1.7 统计分析

采用SPSS13.0 进行统计分析，对结果进行单因素方差分析，采用Duncan’S 多重比较分析不同处理间的差异，以P＜0.05 作为差异显著的判断标准。

2 结果与分析

2.1 纳米银对虾苗的急性毒性

虾苗死亡率与纳米银推荐使用浓度（0.5 mL/m3）倍数的关系见图1（a）（b）。由图1 可见，纳米银对虾苗的96 h LC50为推荐使用浓度的2 241.54倍，48 h LC50为推荐使用浓度的5 421.70 倍。96 h和48 h 的安全浓度（SC）（按0.05 的应用系数）分别为56.04 和135.54 mL/m3，均远高于推荐使用浓度。由此可见，在推荐使用浓度范围内，金沙纳米银对对虾不会产生毒副作用。文献[6]中，5～11 nm 的纳米银对南美白对虾苗的24h LC50为91 mg/L；而250 mg/L、20 nm 纳米银，28 d 对克氏原螯虾（Procambarus clarkii）的致死率为43%[7]；5 d 内10 000 mg/L 的10～55 nm 纳米银，对淡水蟹（Potamanautes perlatus）成体的致死率为70%[8]；而60～120 nm 的纳米银，对淡水蟹（Paratelphusa jacquemontii）成体96 h LC50为0.77 mg/L[9]。由此可见，纳米银对水生甲壳动物的毒性，与纳米银粒径、生物种类等相关。由于本试验采用的商业产品浓度，不是纳米银的直接浓度，因而得到产品的LC50和SC 较高。

图1 虾苗死亡率与纳米银推荐使用浓度倍数的关系

2.2 纳米银处理对水体弧菌数量的影响

纳米银对大肠杆菌（Escherichia coli）等多种病原菌的最小抑制浓度为12.5～140.0 mg/L，随纳米银粒径和病原种类而变化[10]。弧菌是对虾的重要病原菌群，已有研究[2，4，11]表明，不同类型的纳米银材料对多种弧菌在内的水产病原菌，有显著的杀灭、抑制作用。本试验中，纯净水（CJS）培养未见弧菌，天然海水（TRHS）有少量弧菌，添加了纳米银的养殖水（NMYYZS）比天然海水弧菌数量多，周边虾池水（ZBXCS）的各类弧菌数量明显比天然海水和试验养殖水多（图2）。由此可见，金沙纳米银对南美白对虾养殖水体中的弧菌，具有明显的杀灭和抑制作用。

图2 不同水体弧菌密度

2.3 纳米银对水体弧菌的杀灭效果

金沙纳米银对水体弧菌杀灭效果见表1。由表1可见，周边虾池水体中有很多的各类弧菌，总弧菌密度达到1 407 cells/mL，副溶血弧菌密度为37.89 cells/mL，创伤弧菌、溶藻弧菌、河弧菌密度分别为351.58，154.21 和864.21 cells/mL。在用0.5 mL/m3的金沙纳米银消毒剂处理24 h 后，各类弧菌的数量都显著减少，其中副溶血弧菌完全被杀灭。因此，使用纳米银药物来杀灭养殖水体中的病原微生物，能够起到较好的作用。

表1 金沙纳米银对水体弧菌杀灭效果①cells/mL

2.4 纳米银对对虾体内弧菌数量的影响

不同环境对虾体内弧菌数量见图3。由图3 可见，在按推荐方法（每10 d 添加0.5 mL/m3）使用金沙纳米银产品的养殖池中，试验养殖虾（TS）体内的总弧菌数和各类弧菌数比较少，而周边未使用纳米银产品的养殖虾（CS）体内的各类弧菌和总弧菌数都较多，周边海区捕获的野生虾类长毛对虾（P.P）、宽沟对虾（P.L）、周氏新对虾（M.J）的弧菌数量比试验养殖虾多，比周边虾池的养殖虾少。由于检测的弧菌对对虾来说是致病菌，因此，试验结果表明，使用金沙纳米银作为疾病预防的药物，能够提高养殖生物的安全性。

图3 不同环境对虾体内弧菌数量

2.5 纳米银对水体银浓度的影响

金沙纳米银对水体银浓度的影响见表2。由表2 可见，周边天然海水的银浓度较低，仅为0.02～0.04 μg/L；用金沙纳米银处理后的天然海水银浓度，随使用后时间的延长而降低，由120.91 降低至98.90 μg/L；试验养殖水体的银含量为91.73 μg/L，而周边虾池水体未检出银浓度。

表2 金沙纳米银对水体银浓度的影响

纳米银优良的抗菌特性，为人类的多领域应用提供了便利，但同时也对不同类群的水生生物具有不同程度的毒性[12-22]。作为一种贵重的重金属，银一般不作为环境中污染物的指标，但在工业领域的废水排放中有限制标准，如文献[23-25]等规定，总银的排放标准为0.3 或0.5 mg/L。而海洋环境相关质量标准，如文献[26-27]未对其含量做出规定。本试验结果表明，纳米银药物会将少量的银排放到环境中。

2.6 纳米银对虾体银含量的影响

Griffitt 等[28]研究发现，斑马鱼鳃和身体的纳米银累积量与暴露的浓度正相关。虹鳟（Oncorhynchus mykiss）经10 d 的纳米银暴露后，鳃和肝脏中的纳米银含量可达到＜2 μg/g 的水平[29]。本试验养殖虾每100 g 银含量为20～35 μg，并随养殖密度的增加而升高。周边的养殖虾银含量极低，周边野生的虾类墨吉对虾（F.M）、宽沟对虾（P.L）、中国毛虾（A.C）每100 g 银含量低于10 μg（图4）。因此，使用了纳米银产品的养殖虾的银累积量相对较低。作为一种贵金属，银在食品[30]或食品添加剂[31]中的含量未做出限量规定，但过高的银含量是否会对养殖对虾的生理活动产生不良影响，以及对其食品安全性产生影响，需要进一步研究。

图4 试验养殖虾与野生虾每100 g 银含量

3 结语

纳米银类药物由于具有良好的吸附性和渗透性，可作为抑菌和杀菌药物。本试验表明，金沙纳米银药物对虾苗具有较高的安全浓度，并对水体和虾体的副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、河弧菌都有明显的杀灭和抑制作用，可作为一种极有潜力的对虾养殖病害预防药物。但金沙纳米银药物会引起养殖水体和养殖对虾银含量的增加，其可能存在的环境和食品安全风险，需要加强关注。