探究滤泡辅助性T细胞在溃疡性结肠炎中的作用

2024-01-24 00:02:54黄伟航林艳芬
黑龙江医药 2023年24期
关键词:流式滤泡溃疡性

黄伟航,林艳芬

1.广州市番禺区沙湾镇社区卫生服务中心,广东 广州 511483;

2.广州医科大学附属第二医院检验科,广东 广州 510260

溃疡性结肠炎(UC)作为一种累及结直肠黏膜及黏膜下层为主的慢性炎症性肠道疾病,近年来发病率逐年上升,主要诱因包括环境因素、饮食结构、微生物影响及心理因素等,然而该病的发病机制尚不明确[1]。目前UC 的治疗基本以局部直肠给药为主,然而这种治疗方式只能部分缓解病情,且存在疾病容易复发和药物响应个体差异大的缺点,严重影响患者的生存质量[2-3]。因此,挖掘溃疡性结肠炎特异性免疫标志物,寻找有效干预靶点,对于疾病的早期诊断与针对性治疗具有重要意义。据文献[4]报道,滤泡辅助T细胞(Tfh)作为一群独立的CD4+T效应细胞亚群,定位于淋巴滤泡,主要功能是辅助B 细胞增殖产生抗体,参与体液免疫应答。该群细胞的表型特征为高表达滤泡归巢趋化因子受体CXCR5,高表达细胞因子白介素(IL-21)和转录因子Bcl6。IL-21 可诱导Tfh 的分化并促进细胞表面CXCR5 的表达,Bcl6 对于Tfh 转移到淋巴滤泡和B细胞生发中心(GC)的形成不可或缺[5]。已有研究[6]表明,Tfh 在SLE 等自身免疫性疾病患者中呈现上调,同时,狼疮发病小鼠过程中也伴随着Tfh 细胞数量的增加[7]。基于上述发现,Tfh 被认为在多种自身免疫性疾病的发生发展中扮演重要角色,为疾病治疗提供靶向Tfh 细胞的新思路[8-9]。尽管如此,关于Tfh 细胞在UC 疾病中的作用相关报道仍较少。因此,探究Tfh 在溃疡性结肠炎中的作用,将为阐述UC 的免疫学发病机制与疾病的针对性治疗提供新的思路和靶点,现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年1 月—2019 年12 月广州医科大学附属第二医院25 例UC 患者临床外周血标本作为实验组。参考2018年中华医学会消化病学分会对溃疡性结肠炎诊断与治疗的共识意见中的诊断标准,纳入以下患者:(1)年龄和性别不限;(2)结肠镜检、黏膜活检后可确诊为溃疡性结肠炎的人群。排除标准:合并其它系统严重疾病。再选取25 名同年龄组健康成人(HC)外周血标本作为对照组,两组受试者之间年龄、性别等一般资料具有可比性(P>0.05)。本研究经广州医科大学附属第二医院医学伦理委员会批准。

1.2 主要实验试剂

Anti-human 流 式 抗 体 CD45 (APC-Cy7), CD3(BV421),CD4(FITC),CXCR5(PE),Bcl6(PE-Cy7)均购自美国Biolegend 公司; Trizol,逆转录试剂盒,qRT-PCR 试剂盒,ELISA 试剂盒(IL-21)购自Invitrogen公司;人淋巴细胞分离液Ficoll购自GE公司。

1.3 外周血单个核细胞PBMC 的分离与Tfh 细胞的流式检测

使用含EDTA 抗凝管采集UC 患者与健康对照的外周血标本,离心后对上层血浆进行分离冻存,剩余血液中加入等体积的磷酸盐缓冲液(PBS),充分混匀。随后缓缓加入到人淋巴细胞分离液Ficoll 的上层(保持清晰分层界面),进行离心(离心条件为20 ℃, 升速为5 降速为0,时间20 min)。离心结束后,吸取中间白膜层细胞至50 mL离心管中,往其中加入10倍体积的PBS后进行离心,弃上清,收集细胞沉淀,此沉淀即为所需的外周血单个核细胞(PBMC)。通过流式细胞仪对获得的PBMC 细胞进行如下检测: Tfh的流式染色使用1×106细胞;Bcl6的流式染色使用2×106细胞,在Tfh染色的基础上进行破核与核内转录因子染色。随后进行抗体孵育,将标有抗体的细胞置于4 ℃孵育30 min,后加入PBS 进行终止。染色完成后,将吹打好的单个细胞进行流式上机检测,最后将采集到的数据使用分析软件Flowjo10.0进行详细分析。

1.4 qRT-PCR实验检测

采集分离获得的PBMC 样品,使用Trizol 试剂进行总RNA 提取。按照Invitrogen 公司逆转录试剂盒与qRT-PCR试剂提供的使用说明书进行标准化操作。检测基因序列如下: GAPDH (Forward: 5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3';Reverse:5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3');Bcl6(Forward:5'-GGAGTCGAGACATCTTGACTGA-3',Reverse:5'-ATGAGGACCGTTTTATGGGCT-3')。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t 检验。计数资料以例数和百分比(%)表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UC患者外周血中Tfh的比例呈显著增加

据文献报道,人外周血中Tfh 细胞的特征性表面分子标记为CD45+CD3+CD4+CXCR5+,在系统性红斑狼疮等自身免疫病患者外周血中,Tfh 细胞数量较正常人显著增加,且伴随Tfh 相关功能分子如ICOS、IL-21 等表达上调[10]。采集外周血分离PBMC 后,利用流式细胞术对PBMC 进行分析,发现与对照组相比,实验组外周血PBMC 中Tfh 水平出现显著上升,对照组(2.886±0.557 1),实验组(10.35±1.833)。统计结果显示,实验组中Tfh细胞水平显著上升,差异有统计学意义(P<0.001)。

研究表明,Bcl6 是促进Tfh 细胞发育与功能最为关键的转录调控因子[5,11]。获取两组外周血PBMC 细胞后,提取细胞总RNA并进行mRNA水平的检测,发现关键转录因子Bcl6在UC组中表达增高,采用管家基因GAPDH作为内参进行均一化数据处理。使用流式细胞术进行Tfh 细胞染色,并破核对Bcl6进行染色,检测结果显示,Bcl6的表达明显右移,平均荧光强度显著增高,这一结果说明UC 患者中Bcl6的表达同样增加,与mRNA水平的结果相一致。

在Tfh 发挥调节功能的过程中,Bcl6 转录因子的表达受IL-21 的调控[12]。因此,研究者使用ELISA 试剂盒对血浆中的IL-21 进行了检测,发现与对照组的血浆相比,结肠炎患者血浆中IL-21 的含量呈大幅度增加,差异有统计学意义(P=0.000 3)。此外,血浆中IL-21 与外周血中Tfh的细胞比例有显著的相关性(R2=0.549,P=0.005 8)。这一结果提示,IL-21的含量或许可用于评估患者体内Tfh细胞的表达水平。

3 讨论

迄今为止,溃疡性结肠炎的免疫学发病机制尚未完全阐明,治疗效果并不理想。目前认为,除了个人遗传易感性、外部环境与肠道微生物外,免疫细胞与细胞因子等构成的肠道局部免疫调节网络的异常是UC 发病的重要因素[13]。其中,以Th17和调节性T细胞(Treg)亚群的研究最为常见。已有文献[14-16]表明,UC 患者外周血与肠道黏膜中发现数量明显增多的Th17 细胞,且该细胞浸润水平与肠炎的严重程度呈正相关,一定程度上可作为反映肠炎的标志物使用;而Treg 在UC 中的变化情况目前尚存在争议,但发现其功能是减退的[17-18]。同时,炎性细胞因子IL-17 等在UC 中的表达整体出现上升趋势,而IL-10 等抑炎因子的表达则出现明显下降[19]。综合上述结果,UC 患者中可能存在一定的免疫失衡,包括Th17 与Treg 之间、促炎因子与抑炎因子之间。最新研究[20]表明,免疫治疗在UC 患者中,可作为一种对常规治疗无效的新型治疗方案。现有免疫治疗包括促炎因子相应阻断抗体、Treg 回输等,但总的来说免疫治疗的效果欠佳。导致这一现象的重要原因是目前人们对UC 相关免疫致病机理的理解还不够充分,因此需要深入研究以阐明UC 发病相关免疫调节机制。

Tfh 作为体液免疫的重要调控细胞亚群,其在溃疡型结肠炎中的功能研究至今仍未明确。本研究从Tfh 细胞着手,主要探究了Tfh 在UC 中的表达及作用研究。结果显示,UC 患者中呈现出Tfh 细胞水平的明显上升,说明Tfh可能是影响UC 发病的重要因素之一。因此,本研究进一步探索了其中的分子机制。Tfh 参与体液免疫应答的方式主要为分泌细胞因子IL-21。IL-21 在Tfh 细胞的发生和发育中起关键作用,可诱导Tfh 的分化并促进其表面CXCR5的表达[4]。而Bcl6 作为最关键的转录调控因子,其对于Tfh 转移到淋巴滤泡与生发中心的形成不可或缺。在本研究中,研究者运用流式细胞术检测了Tfh 细胞核内Bcl6 的表达情况,发现其水平在患者中呈显著升高。同时,检测了PBMC 细胞中Bcl6 在mRNA 水平的表达,结果显示与蛋白水平结构一致。然而,由于PBMC 中Tfh 比例很低(约占PBMC 所有细胞的0.2%),流式分选难度较大,因此仅使用PBMC 细胞进行检测,这一结果虽不够准确,但也能够在一定程度上与流式检测的蛋白水平结果相互吻合。Bcl6 的转录表达主要受上游细胞因子IL-21 的调控,因此,下一步研究者检测了UC患者血浆中IL-21的含量,结果显示,细胞因子IL-21的含量呈显著上调。此外, 研究者还发现在外周血中,IL-21的含量与Tfh的水平呈现显著的正相关。上述结果提示Tfh细胞可能通过细胞因子IL-21来影响Bcl6的表达,进而促进UC的发生。

综上所述,本研究中,UC 患者Tfh 细胞显著增加,且Tfh中Bcl6的表达水平上升,提示Tfh可能促进了溃疡性结肠炎的发生,该种促进作用可能与其胞内产生的大量细胞因子IL-21密切相关。本研究中Tfh的相关发现可为临床免疫治疗提供潜在的应用价值与新的思路。

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