参芪地黄汤联合司美格鲁肽对2型糖尿病大鼠氧化应激水平的影响

冯庆春，卢丙艳，宋轶

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种多系统损害的临床代谢综合征，其临床特征表现为慢性血糖升高，多由胰岛素分泌及作用缺陷导致[1]。作为慢性糖脂代谢异常型疾病，DM 近几年发病率居高不下，2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是DM 的主要类型[2]，目前常规治疗药物可较好地控制T2DM 及其各种并发症，尤其对难治性T2DM 患者，其较强的临床依赖性及副作用仍对患者的生存质量产生不利影响[3]。氧化应激(oxidative stress，OS)是指机体氧化与抗氧化防御系统失衡的一种状态，在衰老及疾病调控中发挥重要作用[4]，当T2DM 患者血糖升高时，活性氧(reactive oxygen species，ROS)会受高糖信号刺激，导致生成水平过高并超出抗氧化防御系统的自我调控范围，导致OS，并进一步调控相关信号通路使胰岛β 细胞功能受损，最终造成T2DM[5]。因此，探讨OS 在T2DM 的发病机制及以OS 作为潜在靶点的调控治疗方案具有重要临床意义。

DM 属于中医“消渴”范畴，阴虚燥热是其关键病机，其中燥热为标、阴虚为本，阴津亏虚则燥热内生，燥热亢盛则阴津益虚，其主要病位涉及上焦肺燥阴虚，中焦胃失濡润、脾不健运，下焦肾失滋养，故津液运化失调，则生消渴[6-8]。中医药防治T2DM 具有多组分、多靶点、多机制的作用优势。参芪地黄汤由人参、黄芪、熟地黄、山药、茯苓、牡丹皮、山茱萸构成，可益气养阴清热，健脾滋肾固涩，在改善T2DM 患者的临床表现中具有较好效果[9-11]。司美格鲁肽作为新型长效胰高糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)类似物，对血糖具有良好的调控作用。本研究采用T2DM 大鼠模型，探究参芪地黄汤联合司美格鲁肽对T2DM 糖脂代谢及OS的改善作用机制，以期为临床合理应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性清洁级SD 大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证编号：SCXK(京)2021-0006，饲养于中国医学科学院放射医学研究所动物实验中心，相对湿度保持56%～60%，饲养温度保持20～25 ℃，保持12 h 光照和12 h 黑暗的光照周期。

1.1.2 主要试剂及仪器 盐酸二甲双胍片(默克，货号ACH5727)；司美格鲁肽(诺和诺德，货号202211BEL1)，三酰甘油(triglyceride，TG)含量检测试剂盒(索莱宝，货号BC0620)，血清总胆固醇(total cholesterol，TC)含量检测试剂盒(索莱宝，货号BC1980)，低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)含量生化试剂盒(索莱宝，货号BC5330)，糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，GHb)免疫酶联试剂盒(江莱生物，货号JL12389)，ROS 试剂盒(上海酶联，货号ML926281)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测试盒(上海酶联，货号ML092620)，过氧化氢酶(catalase，CAT)检测试剂盒(上海酶联，货号ML095171)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒(南京建成，货号A003-1-2)，多功能酶标仪(美谷分子仪器公司，ZX21)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型复制及分组 采用随机数字表将40 只清洁级雄性SD 大鼠分为正常对照组(Control group)10 只及T2DM 动物模型复制组30只，Control 组大鼠喂养普通饲料，T2DM 动物模型复制组喂养高糖、高脂饲料，连续饲养4 周后，采用1 次链脲佐菌素(streptozocin，STZ)腹腔注射25 mg/kg，STZ 注射3 d 后测定大鼠血糖，将空腹血糖(fasting blood glucose，FPG)≥11.0 mmol/L，餐后2 h 血糖(2 h PG)≥16.7 mmol/L 的大鼠随机再分为T2DM 模型组(T2DM group)、二甲双胍干预组(Metformin group)、参芪地黄汤及司美格鲁肽联合干预组(Combination group)，每组各10 只，用于后续实验。

1.2.2 干预方案 Combination 组大鼠采用参芪地黄汤联合司美格鲁肽干预，根据人与动物等效剂量折算，按参芪地黄汤水煎液生药7 g/(kg·d)灌胃给药，1 次/d；司美格鲁肽3.6 μg/kg 腹腔注射给药，1 次/周。Metformin 组大鼠给予盐酸二甲双胍200 mg/(kg·d)，Control 组及T2DM 组大鼠给予等容积蒸馏水，灌胃1 次/d，连续干预4 周。

1.2.3 糖脂代谢水平检测 各组大鼠待干预结束后24 h，抽取尾静脉血测定FPG 含量；将血液样本低温离心，离心条件设置为4 ℃温度下以转速为3 000 r/min 离心10 min，采用分光光度法测定上层清液的GHb 含量，考察各组大鼠血糖代谢情况；微量法测定血清TG、TC、LDL 含量，考察各组大鼠血脂代谢情况，所有操作参照试剂盒说明进行。

1.2.4 氧化应激水平测定 大鼠血清ROS 水平采用ELISA 法测定；采用水溶性四唑盐(Watersoluble tetrazolium salt-8，WST-8)法检测SOD 活性；采用紫外法检测CAT 含量；采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法检测MDA 含量，具体操作按试剂盒说明进行。

1.3 统计学方法 采用IBM SPSS Statistics 26 软件对数据进行统计处理，以均数±标准差(±s)表示，检验正态性分布及方差齐性，满足则采用单因素方差分析(One-way ANOVA)；数据不满足正态分布，则采用非参数Kruskal-walisH检验，P＜0.05 作为显著性水平标准。

2 实验结果

2.1 对血糖水平的影响 与Control 组相比，T2DM 组大鼠FPG 含量显著升高(P＜0.01)，CHb 水平显著升高(P＜0.01)，糖代谢水平异常升高；与Model 组相比，Metformin 组大鼠FPG 及CHb 水平均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，参芪地黄汤及司美格鲁肽联合干预组后，大鼠FPG 及CHb 水平不仅较Model 组显著降低(P＜0.01)，且联合干预组大鼠CHb 水平显著低于Metformin 组(P＜0.05)，表明参芪地黄汤联合司美格鲁肽干预可有效改善T2DM 大鼠血糖水平，且对GHb 改善程度优于二甲双胍，见表1。

表1 各组大鼠FPG、GHb 水平比较(±s)

表1 各组大鼠FPG、GHb 水平比较(±s)

注：FPG=空腹血糖，GHb=糖化血红蛋白；与Control 组比较，**P＜0.01；与Model 组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与Metformin组比较，#P＜0.05。

GHb/(nmol·L-1)854.69±43.46 952.73±66.21**887.53±56.65△879.46±53.03△△＃组别Control 组Model 组Metformin 组Combination 组例数10 10 10 10 FPG/(mmol·L-1)5.72±1.28 14.32±1.67**9.95±0.75△△8.74±1.03△△

2.2 对血脂水平的影响 与Control 组相比，Model组大鼠TG、TC、LDL 含量均显著升高(P＜0.01)，脂代谢水平异常升高；与Model 组相比，二甲双胍干预后，大鼠TG、TC、LDL 含量均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，脂代谢水平显著改善；参芪地黄汤联合司美格鲁肽干预后，大鼠TG、TC、LDL 含量均明显降低(P＜0.01)，且下降程度优于Metformin 组(P＜0.05)，表明参芪地黄汤联合司美格鲁肽干预可有效改善T2DM 大鼠血脂水平，且改善程度优于二甲双胍，见图1。

图1 各组大鼠血脂水平检测

2.3 对氧化应激水平的影响 与Control 组相比，Model 组大鼠ROS 及MDA 含量均显著升高(P＜0.01)，SOD 及CAT 含量均明显降低(P＜0.01)，氧化应激水平异常增高；与Model 组相比，二甲双胍干预后，大鼠ROS、MDA 含量显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，SOD 含量明显上调(P＜0.05)；Combination组大鼠ROS 及MDA 表达水平显著下调(P＜0.01)，SOD 及CAT 含量显著上调(P＜0.01)，且ROS 及CAT 改善程度优于Metformin 组(P＜0.05，P＜0.01)，表明参芪地黄汤联合司美格鲁肽干预可有效改善T2DM 大鼠氧化应激水平，见图2。

图2 各组大鼠氧化应激水平检测

3 讨论

DM 作为一种慢性糖脂代谢异常性疾病，多饮、多食、多尿及体质量减少的“三多一少”症状是其典型临床表现，胰岛素分泌不足和/或胰岛素抵抗被认为是主要的发病机制[12]。既往研究发现，通过下调血清TC、TG 及LDL 水平，上调HDL 含量，改善糖脂代谢障碍，可有效改善DM的病理改变[13]，表明脂代谢异常作为DM 的重要发病因素，可引起糖代谢水平异常[14-16]，而T2DM 患者多同时伴有OS 水平的异常改变，其血清MDA、一氧化氮(nitric oxide，NO)等OS 标志物含量会呈现显著升高趋势，而作为抗氧化酶的SOD、CAT 及谷胱甘肽(glutathione，GSH)还原酶等的活性则表现为显著下降，通过治疗后OS 水平会出现相应下调，基于上述证据表明OS 与T2DM 发病关系密切[17]。

OS 作为氧化水平与抗氧化水平失衡的异常状态，可导致大量氧化中间产物生成[18]，其产生的活性氧自由基主要包括ROS 和活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)，ROS 和RNS 过量生成则加剧细胞内氧化及抗氧化的失衡，最终导致脂质过氧化以及蛋白质、核酸等生物大分子变性，对机体造成氧化应激损伤，而在高血糖环境刺激下，蛋白质发生非酶糖基化，产生不可逆的高级糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)，最终诱导机体产生ROS，消耗我们体内的SOD、CAT 等抗氧化系统组分[19]，并参与胰岛素分泌，影响糖元生成及葡萄糖摄取相关信号转导通路的调控，影响胰腺β 细胞的数量和功能，加剧葡萄糖摄取和利用障碍，进而就会导致DM。OS 还参与T2DM 的炎症病理过程，是T2DM 多系统并发症的重要驱动因素[20]。盐酸二甲双胍作为重要的一种口服降糖药物，有助于机体提高对胰岛素敏感性及外周葡萄糖的摄取利用，但临床上仅采用盐酸二甲双胍治疗效果存在局限性，难以获得理想的治疗效果[21]。司美格鲁肽注射液主要以天然GLP-1 分子为基础，通过药物分子的改造显著延长了体内半衰期，临床应用就有较好的降糖效果，但部分不良反应也较为显著[22]。中药多组分、多靶点、多机制作用优势，联合应用可显著弥补当前用药方案的不足。

中医认为T2DM 多因先天禀赋不足、长期饮食不节、情志失调等因素，导致三焦阴虚火旺，故患者出现口渴欲饮、食欲亢进、乏力消瘦等临床表现，阴虚则燥热，燥热则津亏益甚。肺燥阴虚，胃失濡润，脾失健运，肾失滋源，阴虚火旺，则生消渴，《素问》曰：“病有口干者……转为消渴”[23-25]。清代医家沈金鳌在其《杂病源流犀烛》中创制参芪地黄汤，方中君药人参，大补元气，益气生津；黄芪、山药可助人参益中焦而升清降浊，益肺胃之津；茯苓健脾渗湿助运；山茱萸补肾涩精益气；生地黄、牡丹皮凉血生津，全方共奏益气养阴清热，健脾滋肾固涩之效[26-28]。现代药理研究表明，参芪地黄汤可显著改善T2DM 患者血糖水平，上调IgG、IgA 水平，改善TNF-α、CRP、IL-6 炎症因子水平[29]，通过调节MDA、SOD、GSH 水平，对糖尿病肾病具有显著的改善作用[30-32]。

本研究基于T2DM 大鼠模型探究参芪地黄汤联合司美格鲁肽的干预效果，研究结果表明，参芪地黄汤联合司美格鲁肽可显著降低T2DM大鼠FPG、CHb、TG、TC 及LDL 含量，调控糖脂代谢异常，下调ROS 及MDA 生成，抑制机体氧化水平，上调SOD 及CAT 生成，促进抗氧化水平，其对T2DM 糖脂代谢异常的改善作用机制可能与调控氧化应激水平有关。