香辛料体外阻断NDMA 及清除自由基的研究

陈瑶绵，罗诗茵，潘子强，李 琳

（1.电子科技大学中山学院，广东中山 528402；2.佛山科学技术学院，广东佛山 528200）

0 引言

N- 亚硝基化合物（NDMA） 是一类危害性极高的化学致癌物，流行病学调查表明，人类很多癌症如胃肠癌[1]、食道癌[2]、肝癌[3]等可能与亚硝胺有关。因此，采用适宜且科学的方法有效阻断亚硝胺的生成具有重要的健康效应。

目前，虽有不少有关亚硝胺致癌机理的研究，但尚无成熟观点，有学者提出自由基反应可能与亚硝胺致癌机理有关[4]；亚硝酸盐作为合成亚硝胺的重要前体物质之一，有研究认为抑制或降低亚硝酸盐也可阻断亚硝胺的合成。有研究表明，香辛料具有阻断亚硝胺生成的效果，但其阻断机理尚不明晰。香辛料在食品加工发挥着独特的调味作用，并因其所含的生物活性物质而表现出健康效应[5]。因此，确定常见香辛料对亚硝胺的阻断效应并探讨其抑制机理值得深入开展。

以常见的香辛料（丁香、石榴皮、乌梅、八角、鼠尾草、大蒜及生姜） 为原料，采用不同提取方式（水浸提法、醇浸提法） 对其活性成分进行提取，在体外模拟胃液环境下，比较不同香辛料提取物对NDMA 的阻断率，选出最适宜的提取方法。同时，通过香辛料提取液清除亚硝胺的前体物质（亚硝酸盐） 和抗氧化能力探索其可能存在的阻断机理。在此基础上，选择阻断率最佳的香辛料进行复配，探索适宜的复配组合并考查其可能存在的协同效应。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

八角、丁香、乌梅、石榴皮、鼠尾草、大蒜及生姜，广东宝元堂药业有限公司提供。

试验试剂：盐酸二甲胺、盐酸萘乙二胺、α - 萘胺、焦性没食子酸、邻苯三酚、α - 核糖，上海阿拉丁公司提供；盐酸，广州化学试剂厂提供；柠檬酸钠、碳酸钠、对氨基苯磺酸、无水乙醇、95%乙醇，天津市百世化工有限公司提供；亚硝酸钠、EDTA，天津市永大化学试剂有限公司提供；维C，天津市鼎盛鑫化工有限公司提供；硫酸亚铁，国药集团化学试剂有限公司提供；磷酸缓冲液、过氧化氢，自配。

1.2 仪器与设备

N-1210B 型旋转蒸发仪、NVP-1000 型隔膜真空泵、CCA-1112A 型冷却水循环装置，上海爱朗仪器有限公司产品；HH-6 型恒温水浴锅，宏华仪器厂产品；YP6002 型电子天平，衡正电子仪器有限公司产品；超净工作台，博迅实业有限公司产品；高速冷冻离心机，广州格卢瑞生命科学有限公司产品；V1100 型可见分光光度计，上海三信仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 香辛料提取物的制备

参照张强等人[6]的提取方法并略作修改，将各香辛料破碎成粉状后过40 目筛，按所选提取溶剂分为水浸提法组和醇浸提法组（见图1），制得的香辛料提取液质量浓度相当于100 mg 原药/ mL。

图1 香辛料的不同提取方法

香辛料的不同提取方法见图1。

1.3.2 体外模拟硝化体系的制备和测定

参考马骊珍等人[7]的方法，并略作修改，得到下述方法：反应体系是10 mL，分为空白对照组和试验组。吸取1.0 mL 的香辛料提取液至10 mL 具塞试管中，加入0.5 mol/L 柠檬酸钠- 盐酸缓冲液5.0 mL， 1 mmol/L 亚硝酸钠1.0 mL，1 mmol/L 二甲胺盐酸盐溶液0.5 mL，柠檬酸钠- 盐酸缓冲溶液将反应体系定容至10 mL，于37 ℃下水浴反应1 h（空白对照组用1.0 mL 去离子水代替香辛料提取液）。

取1.0 mL 上述反应的溶液至玻璃器皿中，加入0.5%碳酸钠溶液0.5 mL 终止其反应，紫外灯下放置15 min（液面距灯约15 cm），取出立即加入质量分数为1%的无水对氨基苯磺酸溶液1.5 mL，质量分数为0.1%的α - 萘胺溶液1.5 mL，用去离子水精确定容至5.0 mL，摇匀，室温下静置20 min 显色，于波长525 nm 处测定其吸光度。再测出空白对照组的吸光度，空白对照组为不加香辛料的浓缩液，每组平行测定3 次。阻断率的计算见公式（1）。

式中：A0——空白组的吸光度；Ax——样品的吸光度。

1.3.3 抑制亚硝胺的当量体系的制备和测定

以维C 为标准物质，分别按照0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6，1.8，2.0 mg/mL 的质量浓度加入在体外硝化体系，比较不同质量浓度维C 抑制亚硝胺的情况并绘制其抑制曲线，建立抑制曲线模型。

1.3.4 清除亚硝酸盐的体系制备和测定

参考黄仕彬等人[8]的试验方法并稍作修改：吸取0.2 mL 的7 种香辛料提取液分别加入25 mL 的具塞试管中，先后加入1.0 mL 柠檬酸钠- 盐酸缓冲溶液（pH 值为3） 和1.0 mL 的亚硝酸钠标准溶液混匀后放置于37 ℃的恒温水浴锅中水浴30 min。取出后立即加入质量分数为0.4%的对氨基苯磺酸溶液1.0 mL，4 min 后加入质量分数为0.2%的盐酸萘乙二胺溶液0.5 mL，并用去离子水定容到刻度线，混匀放置15 min。用分光光度计于波长546 nm 处测其吸光度，根据公式（2） 计算：

式中：A1——未加香辛料提取液时亚硝酸钠的吸光度，即对照值；

A——加入各香辛料提取液的吸光度。

1.3.5 不同香辛料提取液的抗氧化活性

（1） 不同香辛料清除DPPH 自由基能力的研究。取1.5 mL DPPH（1 mmol/L） 溶液置于具塞试管中，加入1.5 mL 待测液（去离子水1.3 mL 和1 mg/mL 香辛料提取液0.2 mL），振荡混匀，室温避光放置45 min，于波长517 nm 处测其吸光度（Ax），空白调零是体积分数为95%乙醇1.5 mL 加1.5 mL 去离子水，对照为1.5 mL DPPH 溶液加1.5 mL 去离子水，于波长517 nm 处测其吸光度（Ac）。分别以2，1，0.2，0.1 mg/mL 的维C 为参照。样品液对DPPH 自由基的清除能力用清除率A*表示。

（2） 不同香辛料清除·OH 能力的研究。运用Deoxyribose 筛选法，取1.0 mL 香辛料提取液（质量浓度50 mg/mL） 于具塞试管中，加入浓度为5 mmol/L FeSO4·EDTA 混合溶液0.2 mL，再加入0.5 mL α-核糖（10 mmol/L），然后加pH 值7.4 的磷酸缓冲液1 mL，用5 mmol/L H2O2定容至2.9 mL，摇匀开启反应，于37 ℃条件下水浴反应1 h 后，取出加入质量分数为2.8%的TCA 溶液1 mL，质量分数为1.0%的TBA 溶液1 mL，冷却后于波长532 nm 处测定吸光度Rx，对照组不加香辛料提取液R'，空白管用磷酸缓冲液2 mL 加去离子水2 mL 调零。

香辛料提取液对于·OH 的清除能力用R 表示：

（3） 不同香辛料清除超氧阴离子自由基（O2-·）能力的研究。采用邻苯三酚自氧法研究超氧阴离子自由基的清除能力，在试管中加入2.8 mL pH 值8.2，50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液，其中空白组加0.1 mL去离子水，25 ℃下保温10 min，取出后加入0.1 mL 10 mmol/L HCl 溶液；对照组（F'） 加0.1 mL 去离子水，25 ℃保温10 min，取出后加0.1 mL 邻苯三酚溶液；样品组（Fx） 加入0.1 mL 香辛料提取液（50 mg/mL），在25 ℃条件下保温10 min，取出后加入0.1 mL 邻苯三酚溶液。

香辛料提取液对于超氧阴离子自由基（O2-·） 的清除能力用F 表示：

1.3.6 复配香辛料提取液

综合香辛料对自由基、在模拟体系及对亚硝酸盐的清除率结果，确定石榴皮、丁香、鼠尾草和八角4 种香辛料进行1∶1 复配，分别考查复配香辛料对NDMA 的阻断效果及其对亚硝酸盐的清除效果。

2 结果与分析

2.1 香辛料对NDMA 的阻断能力

2.1.1 不同提取方式对NDMA 的阻断效应

不同香辛料不同提取溶剂的提取液抑制NDMA生成的影响见图2。

图2 不同香辛料不同提取溶剂的提取液抑制NDMA 生成的影响

活性物质具有不同的溶解性，图2 比较了不同提取溶剂对香辛料提取液在NDMA 抑制率的影响。由图2 可知，石榴皮无论采用水浸提法还是醇浸提法，对NDMA 的生成均有较好的阻断效果（阻断率＞90%）；鼠尾草、八角和丁香的水浸提液对NDMA 的阻断率较高；乌梅、生姜和大蒜等的醇浸提液表现出更好的NDMA 抑制作用。

不同香辛料提取液抑制亚硝胺生成（X±s） 见图3。

图3 不同香辛料提取液抑制亚硝胺生成（X±s）

将香辛料用最适的溶剂进行提取，比较不同香辛料提取液对NDMA 的作用。由图3 可知，7 种香辛料提取液的抑制率均＞50%，其中鼠尾草、丁香、八角和石榴皮4 种提取液均达到90%以上，石榴皮含有大量的多酚类物质，对于N - 亚硝胺有抑制的作用；八角含有的茴香醛具有抗氧化性，可能抑制NDMA 生成；丁香中含有丁香酚，鼠尾草中含有迷迭香酸、单宁酸等黄酮类化合物，这些活性物质可能是抑制NDMA 生成的原因。

2.1.2 香辛料抑制NDMA 的维C 当量水平

维C 抑制率曲线及其S 型拟合曲线见图4。

图4 维C 抑制率曲线及其S 型拟合曲线

选择维C 为阳性对照，测定不同质量浓度维C对NDMA 的阻断能力并建立数学模型，得到Logistic拟合曲线为Y=88.37-73.91/(1+X/0.88)(R2=0.973 5)，利用该模型确定不同香辛料在阻断NDMA 生成方面的维C 当量水平。

不同香辛料在阻断NDMA 的维C 当量见表1。

表1 不同香辛料在阻断NDMA 的维C 当量

2.1.3 不同香辛料对亚硝胺前提物质- 亚硝酸盐的清除效应

亚硝酸盐作为亚硝胺的前体物质之一，清除亚硝酸盐可能是香辛料具有阻断NDMA 生成的原因。

不同香辛料提取液对亚硝酸盐的清除率（X±s）见图5。

图5 不同香辛料提取液对亚硝酸盐的清除率（X±s）

由图5 可知，7 种香辛料提取液在体外对亚硝酸盐具有不同的清除能力，说明香辛料提取液中的活性物质均能够与体系中的亚硝酸根发生相互作用，清除NDMA 最强的是石榴皮提取液，而清除亚硝酸盐能力最强的是丁香，清除能力最弱的是生姜。

2.2 不同香辛料对不同自由基的清除效应

自由基是生命活动时产生的一种带有未成对电子的基团，对调节机能的平衡方面发挥着重要作用。研究发现，香辛料提取物对清除自由基有一定作用，如生姜汁对亚硝胺的合成有显著的阻断作用且具有较强的热稳定性[9]，还能减少由亚硝胺代谢产生的自由基[10]。姚瑶等人[11]发现丁香、桂皮和生姜的水浸提物对于酱牛肉抗氧化能力也较强，其中香辛料水浸提物的总酚含量与抗氧化能力呈正相关。朱妙琴等人[12]发现大蒜和生姜提取液在中性或偏酸性条件下对自由基有一定的清除率。敬小波[13]研究发现常见的花椒、生姜及丁香均有良好的抗氧化能力。

比较7 种样品液对3 种自由基（DPPH·、·OH 、O2-·） 的清除能力.

不同样品液对DPPH·的清除能力（X±s） 见表2，不同香辛料提取液对自由基的清除能力（X±s）见图6。

表2 不同样品液对DPPH·的清除能力（X±s）

图6 不同香辛料提取液对自由基的清除能力（X±S）

由表2 可知，7 种香辛料提取液在一定程度上都具有清除DPPH 自由基的效果，其中1 mg/mL 的丁香和石榴皮效果最好，分别为（46.18±0.78） %，（61.46±2.53） %，与0.1 mg/mL 的维C 相当。

由图6 可知，7 种香辛料（50 mg/mL） 对于生成速度快且寿命短的·OH 具有清除能力，其中生姜和大蒜的醇提液对于羟基自由基的清除效果最好，清除率分别为87.89%和87.31%；对于O2-·清除率从大到小依次为鼠尾草＞石榴皮＞丁香＞乌梅＞生姜＞八角＞大蒜（50 mg/mL）。

2.3 复配香辛料的交互作用

研究发现，很多天然提取物复配时可产生协同增效作用，因此复配成为了天然产物研究领域的热点。陈文静等人[14]发现花椒、八角、丁香、麻椒及迷香组成的复配混合液可抑制亚硝胺。马俪珍等人[7]研究发现桂皮、柚子皮、八角和花椒提取液在复配时阻断NDMA 的效果明显。付丽等人[15]研究表明，当八角、桂皮和生姜混合液复配比为1∶1∶2 时，对亚硝酸盐的清除率高达88.17%。还有研究发现，花椒与八角按质量比1∶2 复配对亚硝酸钠的清除具有协同增效作用[16]。

将具有阻断NDMA 生成的4 种香辛料按照1∶1进行复配，考查其阻断NDMA 生成的效果。

单一及复配香辛料提取液阻断效果对比见图7。

图7 单一及复配香辛料提取液阻断效果对比

其中，复配后的混合提取液对NDMA 的阻断效果最好的组合为石榴皮+鼠尾草（1∶1），阻断率为70.12%。可推断出复配香辛料对抑制NDMA 生成具有比较理想的效果；4 种香辛料复配后对于亚硝酸盐的清除率均高于单一香辛料，其中清除效果最好的组合是石榴皮+鼠尾草，清除率达到75.28%。

3 结论

7 种香辛料提取液在抑制NDMA 生成和清除亚硝酸盐方面均具有一定的作用，同时也具有清除自由基的能力；初步的复配试验发现，石榴皮和鼠尾草的结合可能存在协同增效作用；香辛料阻断NDMA 生成的机理尚不明显，值得进一步研究。