贮藏过程中卷心菜硝酸盐潜在安全风险的变化

刘宇新，邬松恒，崔 宪，马 静，黄振侠，欧阳仉孙，辛宜聪，徐德胜，熊江花

（1.江西省农业生态与资源保护站，江西南昌 330047；2.南昌大学食品学院生物质转化教育部工程研究中心，江西南昌 330047）

0 引言

蔬菜是我国居民膳食结构的重要组成部分，根据《中国居民膳食指南（2016）》建议，居民每日蔬菜摄入量应达到300～500 g。叶类蔬菜富含大量维生素和膳食纤维，是人们主要食用的蔬菜种类。叶类蔬菜作为一类硝酸盐富集型作物，其中高含量的硝酸盐在贮藏和食用过程中易转变为有害的亚硝酸盐，从而产生硝酸盐潜在风险。蔬菜中亚硝酸盐的产生途径主要有2 个，一是囤积的蔬菜被微生物侵染，硝酸盐在微生物产生的硝酸还原酶的作用下被还原成亚硝酸盐[1]；二是人体摄入的大量硝酸盐约有25%会通过唾液腺分泌，在口腔细菌的作用下，最终总摄入硝酸盐量的6%～7%会在口腔中被转化为亚硝酸盐[2]；许多研究表明蔬菜中的天然抗氧化物，如抗坏血酸和多酚，能将亚硝酸盐还原为NO 等物质，从而抑制亚硝酸盐的危害[3-4]。因此，蔬菜的硝酸盐潜在安全风险应当取决于硝酸盐含量与抗氧化能力之间的平衡关系。基于此，前人的研究中提出了可通过抗氧化性/ 体内亚硝酸盐比值（Antioxidant/in vivo nitrite ratio，A/N） 反映和评价蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐对人体健康的安全性[5-6]。

由于蔬菜自身酶系和环境微生物的作用，蔬菜的硝酸盐、亚硝酸盐含量和抗氧化能力在蔬菜贮藏过程中不断发生变化，不同的贮藏条件与贮藏方式也会影响蔬菜硝酸盐含量与抗氧化能力之间的平衡。杨冲[7]的研究表明，空心菜的维C 含量在0，15 ℃贮藏6 d 时分别减少了约50%和80%；而在5，10 ℃贮藏6 d 时反而增加了约23%和9%。林丽萍等人[1]的研究表明，4 ℃冷藏贮藏可降低蔬菜中亚硝酸盐的含量，并使亚硝化峰延迟出现。王倩[8]研究了菠菜、油菜和空心菜在不同贮藏条件下亚硝酸盐含量的变化，其中封闭袋装贮藏的蔬菜亚硝酸盐含量增长要明显大于散装贮藏。目前，大多数研究集中于单独分析蔬菜的抗氧化能力或硝酸盐含量在贮藏过程中变化，而对于叶类蔬菜硝酸盐和抗氧化能力之间平衡关系的变化鲜有报道。

因此，以卷心菜为原料，研究贮藏温度（常温与低温） 和贮藏方式（散装与袋装） 在贮藏过程中对卷心菜的硝酸盐含量、亚硝酸盐含量、总抗氧化能力和微生物群落多样性的影响，并通过A/N 值来反映卷心菜中硝酸盐与抗氧化能力的平衡关系，以此评价卷心菜在短期贮藏过程中硝酸盐潜在安全风险的变化，为人们的饮食健康提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

以试验当天清晨从江西省南昌市某农贸市场购买的卷心菜（“盛春”卷心菜） 为材料，采购后立即运往实验室进行后续试验。

新鲜卷心菜的相关数据见表1。

表1 新鲜卷心菜的相关数据

四硼酸钠、硫酸锌、亚铁氰化钾、还原锌粉、三氯化铁、硝酸钠、亚硝酸钠、乙酸钠，西陇科学股份有限公司提供；乙酸镉、2,2 - 二苯基- 1 - 吡啶并肼基（DPPH）、2,4,6 - 三吡啶基三嗪（TPTZ），上海麦克林生化科技有限公司提供；对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、氨水、冰乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；菌落总数测试片，广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司提供。

1.2 仪器与设备

恒温培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司产品；紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；酶标仪，杭州奥盛仪器有限公司产品；电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司产品；台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品。

1.3 贮藏过程

由于卷心菜个体体积较大，为确保样品均匀分装，从根部将叶片进行切断，在尽量减少叶片伤口的条件下分切为单片叶片，混合后再进行分装至塑料袋内，每组100 g。分装后的卷心菜被分为散装常温、袋装常温、散装低温和袋装低温共4 个试验组。散装处理的试验组直接将样品放入塑料袋中，开口贮藏；袋装处理的试验组将塑料袋中空气尽量排出后扎紧封闭，常温组置于（20±2） ℃常温室内贮藏，低温组置于（2±2） ℃冷藏室内贮藏。以上试验组重复3 次。

各试验组分别贮藏12，24，48，72，96 h 后，取样于-80 ℃冰箱冷冻待测。测定硝酸盐、亚硝酸盐含量、总抗氧化能力、抗坏血酸含量、总酚含量、菌落总数。根据试验结果，取常温贮藏48 h 的样品进行微生物群落多样性分析。

1.4 分析检测方法

1.4.1 硝酸盐和亚硝酸盐含量的测定

硝酸盐和亚硝酸盐测定参考Ding Z 等人[5]的方法，但对预处理过程进行了一些修改。取5.0 g 粉碎卷心菜加入蒸馏水25 mL 和2.6%（W/V） Na2B4O7溶液1.2 mL，并于在70 ℃水浴中保温15 min。随后冷水浴15 min 并加入30%（W/V） 硫酸锌溶液0.5 mL，振荡混匀后再加入15% （W/V） 亚铁氰化钾溶液0.5 mL，振荡混匀。室温静置30 min 后，用定性滤纸过滤并将滤液定容至50 mL，立即分析滤液中的硝酸盐和亚硝酸盐含量。

1.4.2 抗坏血酸含量的测定

抗坏血酸含量的测定参照Mirzaei A 等人[9]的方法，但对预处理过程进行了一些修改。取2.0 g 粉碎卷心菜，加入体积分数为80%乙醇20 mL，冰浴条件下超声处理10 min，而后在4 ℃条件下避光提取24 h。随后于4 ℃条件下以转速10 000 r/min 离心10 min，所得上清液用于测定。

1.4.3 总酚含量的测定

总酚含量的测定参照Mirzaei A 等人[9]和Faller A L K 等人[10]的方法，预处理过程同1.4.2。

1.4.4 总抗氧化能力的测定

（1） DPPH 自由基抑制率。DPPH 自由基抑制率的测定参照周晗等人[11]的方法。

（2） 铁离子还原能力（Ferric reducing antioxidant power，FRAP）。铁离子还原能力测定过程参考Benzie I F 等人[12]的方法，预处理过程同1.4.2。此外，参照Sdiri S 等人[13]的方法，用L - 抗坏血酸（溶于体积分数80%乙醇） 作为标准对照，铁离子还原能力的测定结果表示为抗坏血酸当量。

1.4.5 菌落总数的测定

菌落总数的测定参照《食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定（GB/T 4789.2—2010）》，使用菌落总数测试片进行测定。

1.4.6 微生物群落多样性分析

取常温贮藏48 h 的卷心菜样品，用液氮速冻并研碎，置于灭菌离心管内暂存。样品经由上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rDNA 高通量测序。

1.4.7 硝酸盐潜在安全风险评价方法

A/N 值反映了蔬菜中硝酸盐和抗氧化能力之间平衡关系，Ding Z 等人[5]研究了利用A/N 值来评估果蔬制品中硝酸盐对人体健康的影响。通过A/N 值来反映烹饪过程对蔬菜硝酸盐和抗氧化能力的综合作用，并以此评价蔬菜的硝酸盐潜在安全风险。根据Ding Z 等人[5]的描述，蔬菜中硝酸盐总量的6.5%被用于计算为预测体内亚硝酸盐。A/N 值的计算公式如下：

式中：AAE——抗氧化能力的抗坏血酸当量，mmol/kg；

Ni——亚硝酸盐含量，mmol/kg；

Nv——预测体内亚硝酸盐含量，mmol/kg，相当于硝酸盐摩尔量的6.5%。

1.5 数据处理与分析

所有数据使用SPSS 23.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA），p＜0.05 表示差异显著。使用Origin 2021 软件进行数据处理并绘图。

2 结果与分析

2.1 贮藏过程中卷心菜鲜重的变化

蔬菜在贮藏过程中仍旧进行呼吸代谢和水分蒸腾作用，随着贮藏时间的延长，蔬菜中的水分和有机物会不断减少[7]，因此蔬菜的鲜质量变化能直观地反映蔬菜在贮藏过程中的品质变化。

贮藏过程中卷心菜鲜质量的变化见图1。

图1 贮藏过程中卷心菜鲜质量的变化

卷心菜在袋装贮藏条件下鲜质量的下降速率较慢，贮藏96 h 时袋装贮藏试验组的鲜质量减少量均低于3%（见图1）。在散装贮藏的条件下，卷心菜的鲜质量相对于袋装贮藏条件大幅减少。由于袋装贮藏的封闭环境中水分难以外溢，环境中的湿度上升，抑制了蔬菜的蒸腾作用，减少了水分的散失。除袋装贮藏方式外，贮藏温度对鲜质量也有显著影响（p＜0.05）。在低温贮藏条件下，鲜质量的减少量要明显低于常温贮藏条件，散装常温贮藏的卷心菜鲜质量在96 h 时减少了19.5%，而散装低温贮藏的卷心菜鲜质量在96 h 时仅减少4.6%。

2.2 贮藏过程中卷心菜硝酸盐和亚硝酸盐含量的变化

贮藏过程中卷心菜硝酸盐和亚硝酸盐的含量见图2。

图2 贮藏过程中卷心菜硝酸盐和亚硝酸盐的含量

由图2（a） 可知，卷心菜的硝酸盐含量在贮藏过程中呈先增加后降低的趋势，在贮藏48 h 时散装常温组、袋装常温组、散装低温组和袋装低温组分别增加了69.10%，77.53%，122.34%，78.32%。卷心菜在贮藏初期硝酸盐含量增加是由于在采收和贮藏过程中产生了机械损伤，触发植物抗逆性机制，使得植物组织的呼吸作用加强，此时蔬菜体内的含氮有机物代谢增强，引起硝酸盐含量的增加[14-15]。其中，散装低温贮藏时硝酸盐的增加量最高，可能是由于低温环境对卷心菜产生了低温胁迫，进一步增强植物的抗逆性机制，使硝酸盐含量上升；另一方面，袋装贮藏卷心菜的硝酸盐含量低于同温度下的散装贮藏组，表明袋装条件可能抑制卷心菜中有机物的分解[15]。贮藏48 h 后，卷心菜的硝酸盐含量开始降低，可能是由于蔬菜自身合成代谢开始大量消耗硝酸盐。此外，许多微生物也具有代谢或还原硝酸盐的能力，从而促使卷心菜的硝酸盐含量降低。

由图2（b） 可知，卷心菜在贮藏过程中亚硝酸盐含量呈上升趋势。蔬菜中的亚硝酸盐主要来源于硝酸盐还原酶的作用，正常情况下蔬菜体内形成的亚硝酸盐会被亚硝酸盐还原酶迅速还原成氨，并用于后续的有机物合成。在贮藏过程中，除蔬菜自身含有的硝酸盐还原酶外，侵染蔬菜的微生物也能够分泌硝酸盐还原酶，从而导致亚硝酸盐含量呈上升趋势[16]。

2.3 贮藏过程中卷心菜菌落总数的变化

蔬菜在采收过程中会不可避免地进行剪切和割断，而在后续分销与贮藏过程中也容易因碰撞、挤压和包装而产生新的伤口，给予了微生物侵染蔬菜的机会。微生物可以利用蔬菜内部组织的营养物进行繁殖，产生危害物质的同时引起蔬菜的快速腐败，菌落的数量是影响蔬菜安全品质和贮藏周期的重要因素[17]。

贮藏过程中菌落总数的变化见图3。

图3 贮藏过程中菌落总数的变化

散装常温贮藏时卷心菜的菌落总数增加最多，在12 h 时就已超过104CFU/g，而散装低温贮藏时菌落总数始终没有显著变化（p＞0.05），表明低温条件显著抑制了微生物的生长繁殖，低温贮藏时微生物活动可能不是导致蔬菜硝酸盐安全风险变化的主要因素。

2.4 贮藏条件对卷心菜微生物群落多样性的影响

由于低温贮藏时微生物可能不是影响卷心菜硝酸盐安全风险变化的主要因素，而常温贮藏时微生物菌落总数显著增加（见图3），为进一步分析常温贮藏时的微生物活动对硝酸盐潜在安全风险的影响，因此对常温贮藏48 h 时的样品进行微生物群落多样性分析。

常温贮藏48 h 时样品Alpha 多样性指数见表2。

表2 常温贮藏48 h 时样品Alpha 多样性指数

ACE 指数和Chao1 指数反映了样品中微生物群落物种种类的丰富程度，其数值越高表明微生物群落物种种数越多。由表2 可知，卷心菜在散装贮藏和袋装贮藏48 h 后ACE 指数和Chao1 指数降低。其中，袋装贮藏组的ACE 指数和Chao1 指数高于散装贮藏组，表明袋装贮藏时卷心菜的微生物种类丰富度要高于散装贮藏。

Shannon 指数和Simpson 指数反映了样品中微生物种群的相对密度，Shannon 指数越高表明群落多样性越高，Simpson 指数越高表明群落多样性越低。由表2 可知，散装贮藏和袋装贮藏均导致Shannon 指数升高而Simpson 指数降低，但2 种贮藏方式的差别不明显。

常温贮藏48 h 时微生物群落多样性变化见图4。

图4 常温贮藏48 h 时微生物群落多样性变化

通过16S rDNA 高通量测序对样品上的微生物种类进行鉴定（见图4），假单胞菌属、束毛球菌属、丛毛单胞菌属等菌属为主要菌群。在卷心菜的袋装贮藏过程中，假单胞菌属相对丰度相比原料增加了21.9%。假单胞菌属是一种在植物叶片上广泛分布的细菌，在厌氧条件下能利用硝酸盐进行呼吸代谢[18]。在袋装贮藏的微氧条件下，假单胞菌属利用硝酸盐厌氧代谢的特点使其成为优势菌群，假单胞菌属的大量繁殖可能是导致袋装贮藏时卷心菜硝酸盐增加量相对于散装贮藏更低的原因之一。卷心菜在贮藏48 h 后观察到丛毛单胞菌属的相对丰度增加，且散装贮藏时的相对丰度要大于袋装贮藏。根据李正魁等人[20]的研究，丛毛单胞菌属具有短程硝化功能，能够快速代谢硝酸盐和亚硝酸盐，表明在卷心菜在贮藏过程中硝酸盐含量的降低可能是由于丛毛单胞菌属的作用。

2.5 贮藏过程中卷心菜抗坏血酸和总酚含量的变化

贮藏过程中卷心菜抗坏血酸和总酚含量见图5。

图5 贮藏过程中卷心菜抗坏血酸和总酚含量

卷心菜的抗坏血酸含量在贮藏24 h 时出现了短暂上升，而后持续下降。抗坏血酸是一种不稳定的抗氧化物，因此在贮藏过程中会不断被消耗导致含量降低。由于采收时的切割伤害引发了蔬菜自身的抗氧化机制，蔬菜组织不断用糖类物质合成新的抗坏血酸，导致抗坏血酸含量在贮藏初期短暂增加[21]。此外，贮藏温度和袋装条件对抗坏血酸含量的影响不显著，与前人的研究不符[7]，可能是由于试验中分装处理产生的伤口过多，导致营养物质暴露，加速了抗坏血酸的消耗。

卷心菜的总酚含量在贮藏过程中均呈先上升后下降的趋势，在贮藏48 h 时增加至最大。其中，低温贮藏的卷心菜总酚含量在贮藏前48 h 相对于常温贮藏更低，可能是由于低温贮藏会提高过氧化物酶（POD） 的活性，而POD 酶能催化酚类化合物的氧化和聚合，从而导致总酚含量较低[22]。多酚是蔬菜自然抗逆性的诱导因子之一，贮藏过程前期蔬菜总酚含量的增加可能与蔬菜自身的抗逆性调节有关[23]。

2.6 贮藏过程中卷心菜总抗氧化能力的变化

贮藏过程中卷心菜的总抗氧化能力见图6。

图6 贮藏过程中卷心菜的总抗氧化能力

卷心菜的DPPH 自由基抑制率和铁离子还原能力随贮藏时间均呈先降后升的趋势，在贮藏前期（0～24 h） 分别减少了27.29%～61.19%和18.66%～39.41%，其变化趋势与卷心菜抗坏血酸和总酚含量的变化趋势一致（见图5）。其中，常温贮藏卷心菜的总抗氧化能力在12 h 后开始快速上升，而低温贮藏组则在24 h 后开始上升，表明低温贮藏在贮藏初期抑制了蔬菜自身的抗氧化机制；另一方面，袋装贮藏卷心菜的总抗氧化能力要高于相同温度下散装贮藏的卷心菜，可能是由于相对封闭的贮藏环境减少了卷心菜伤口在空气中的暴露程度，抗氧化物的消耗量相对更低。

2.7 贮藏过程中卷心菜的硝酸盐潜在安全风险评价

抗氧化性/体内亚硝酸盐比值（A/N） 直观地反映了蔬菜中硝酸盐和抗氧化能力之间平衡关系的变化，在前人的体外模型试验中，当抗坏血酸与亚硝酸盐的摩尔比大于2∶1 时，亚硝胺的形成能被完全阻断[5]。因此，基于A/N 值来评估卷心菜中的硝酸盐对人体健康产生的潜在安全风险。该比值的本质是反映蔬菜中硝酸盐被人体摄入后产生亚硝酸盐危害的可能性，比值越高说明硝酸盐潜在安全风险越低。

贮藏过程中卷心菜的抗氧化性/体内亚硝酸盐比值（A/N） 见图7。

图7 贮藏过程中卷心菜的抗氧化性/体内亚硝酸盐比值（A/N）

由图7 可知，卷心菜的A/N 值在贮藏过程贮藏的前24 h 较低，其原因在于贮藏初期（24 h 内） 卷心菜硝酸盐含量增加且总抗氧化能力下降，而在贮藏24 h 后卷心菜的总抗氧化能力开始上升，因而A/N 值开始增加。常温贮藏的卷心菜在12 h 时A/N值最低，而低温贮藏的卷心菜则在24 h 时最低，这一现象与卷心菜总抗氧化能力的变化有关，低温可能延缓了卷心菜自身抗氧化能力的上升，合成抗氧化物的速率要低于常温贮藏；另一方面，袋装贮藏卷心菜的A/N 值要高于同温度条件下的散装贮藏，与硝酸盐含量和总抗氧化能力的变化趋势类似，表明卷心菜在相对封闭的贮藏环境中产生的硝酸盐潜在安全风险更低。

综上所述，卷心菜在袋装常温贮藏时硝酸盐潜在安全风险相对较低。但A/N 值仅代表硝酸盐被人体摄入后产生亚硝酸盐危害的可能性，而非直接反映蔬菜的整体食用安全性，如考虑微生物污染等因素，低温显然能较好地保存原料营养成分，避免微生物生长繁殖。

3 结论

研究了卷心菜在贮藏过程中硝酸盐含量与抗氧化能力之间平衡关系的变化，以此来评价卷心菜的硝酸盐潜在安全风险。低温贮藏有效抑制了菌落总数的增加，但同时也促进了卷心菜硝酸盐含量的增加并降低了总抗氧化能力，因此硝酸盐潜在安全风险相对常温贮藏时更高。袋装贮藏时，具有厌氧代谢硝酸盐能力的假单胞菌属相对丰度明显增加，可能是硝酸盐增加量相对于散装贮藏时更低的原因。基于A/N 值的评价结果，卷心菜在袋装常温贮藏时硝酸盐潜在安全风险更低。研究了贮藏方式对卷心菜硝酸盐潜在安全风险的影响，但对于卷心菜食用安全性的最适贮藏条件，应同时综合考虑其他安全要素。