HPLC-ESI-MS 法检测香菇中甲基硒代半胱氨酸硒代蛋氨酸硒代半胱氨酸含量

胡 超，李琎杰，毛自欣，袁 波，刘塞纳

（江西省检验检测认证总院 食品检验检测研究院，江西宜春 336000）

硒作为人体必需的微量元素之一，有多种免疫与生物学功能，尤其是预防心血管病、抗肿瘤、抗病毒性疾病及抗衰老等作用[1]。与无机硒化合物相比，有机硒化合物生物活性强、毒性低、吸收率高、污染小[2-4]，而且硒不能在人体内合成，必须通过食物中摄取。根据《中国居民膳食营养素参考摄入量》，成人每天的硒摄入量应不少于50 μg[2]，而目前我国人均每日硒摄入量仅为26～32 μg，远低于最低摄入量。因此，对食品中有机硒的含量检测具有很大的研究意义。人体内的有机硒形式主要为硒蛋白和硒代氨基酸，硒代氨基酸主要形式为甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代半胱氨酸（Sec）[13]等。

近年来，富硒农业发展越来越快，农产品的硒含量得到广泛的关注。因此，关于农产品硒含量的检测也越来越重要。

根据现有的国家标准和文献参考，有机硒检测方法中，前处理提取方法有水提取法、酸提取法、酶解提取法和辅助提取法等[4]。主要针对香菇样品中水提取法、酸提取法、酶解提取法[7]对甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）、硒代半胱氨酸（Sec） 的实际提取效果的分析和对比。检测器的选择有高效液相色谱法[10-12]、气相色谱- 串联质谱法[9]、毛细管电泳法等、氢化物发生- 原子荧光光谱法[8]和液相色谱- 电感耦合等离子质谱法（HPLC-ICP-MS）[6]。选择超高效液相色谱串联质谱法（HPLC-ESI-MS）的检测方法研究。液相色谱串联质谱法具有不易受干扰、重现性好、准确度高、灵敏度好等优点[3-5]。该方法省去了繁琐的前处理衍化过程，避免了其他离子干扰，节省了分离时间，可实现大批量多样品的检测，为探究农作物有机硒的检测提供了一定的数据基础。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters Xevo TQD 型超高效液相色谱- 串联质谱联用仪（HPLC-ESI-MS） （三重四极杆），美国Waters 公司产品；XSE105DU 型十万分之一电子天平，瑞士梅特勒托利多公司产品；KQ-400KDE 型超声仪，昆山市超声仪器有限公司产品；TGL-15B 型高速离心机，上海安亭科技仪器厂产品；SHA-CA 型水浴恒温振荡器，上海江星仪器厂产品。

甲基硒代半胱氨酸标准品、硒代蛋氨酸标准品、硒代半胱氨酸标准品（纯度均为99.8%），蛋白酶（酶活力≥30 U/mg），甲醇（MS 纯），甲酸（MS纯），纯净水（娃哈哈）。

富硒香菇，购自当地农贸市场。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

分别准确称取甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸标准溶液5.0 mg，于100 mL 棕色容量瓶中，用水定容。配成质量浓度均为50 μg/mL 的混合标准液，取1.0 mL 储备液至50 mL 棕色容量瓶，水定容，配成质量浓度1.0 μg/mL 的混合标准储备液。分别移取混合标准储备液0.001，0.005，0.010，0.050，0.100，0.200 mL 于10 mL 棕色容量瓶，用空白基质配制成质量浓度为0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL 的标准系列工作液。

1.2.2 提取方法的选择

（1） 水提取法。香菇样品经粉碎机粉碎，准确称取2.0 g 于50 mL 离心管，加15ml 超纯水，涡旋混匀，于60 ℃水浴条件下超声提取1 h，在60 ℃水浴振荡提取24 h，以转速8 000 r/min 离心10 min，上清液移至25 mL 棕色容量瓶，残渣加8 mL 超纯水，超声提取30 min，以转速8 000 r/min 离心10 min，合并上清液，加超纯水定容，混匀，过0.22 μm（PES） 滤膜，供HPLC-ESI-MS 上机检测分析，采用外标定量法检测甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸。

（2） 酸提取法。香菇样品经粉碎机粉碎，准确称取2.0 g 于50 mL 离心管，加6.0 mol/L 的HCl 溶液5 mL 于60 ℃水浴条件下超声提取1 h，于60 ℃水浴中振荡提取24 h，冷却，以转速8 000 r/min 离心10 min，取上清液2.0 mL 置于10 mL 棕色容量瓶，加超纯水定容，混匀，过0.22 μm（PES） 滤膜，供HPLC-ESI-MS 上机检测分析，采用外标定量法检测甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸。

（3） 酶解提取法。香菇样品经粉碎机粉碎，准确称取2.0 g 置于50 mL 离心管，加入20 mg 蛋白酶，加入浓度为0.2 mol/L 的抗坏血酸溶液0.25 mL，加Tris-HCl 缓冲液（10 mol/L） 4.75 mL，漩涡30 s，于37 ℃水浴条件下以转速120 r/min 振荡20 h，避光。于60 ℃水浴超声波提取40 min，降至常温，以转速8 000 r/min 离心10 min，取上清液2.0 mL 置于10 mL 棕色容量瓶，用0.1%甲酸水定容，混匀，通过注射器过0.22 μm（PES） 滤膜，供HPLC-ESI-MS 上机检测分析，采用外标定量法检测甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸。

1.2.3 仪器条件

（1） 液相色谱- 质谱条件。色谱柱：Agilent ZORBAXSB-AQ 型，柱长100 mm，内径3.0 mm，粒径1.8 μm，进样量5.0 μL，流速0.25 mL/min，柱温40 ℃；流动相：A 相0.1%甲酸溶液；B 相甲醇。

梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

（2） 质谱参考条件。电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测，毛细管电压3.0 kV，脱溶剂气温度550 ℃，脱溶剂气流量1 000 L/H，锥孔气流量50 L/H；喷雾电压、离子源温度、脱溶剂温度和氮气流速等参数应优化至最优灵敏度。

定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表2。

表2 定性离子对、定量离子对和碰撞能量

2 结果与分析

2.1 样品检测结果

取同一样品，同时用3 种不同提取方法处理，通过HLPC-MS 的质谱检测，标准曲线质量浓度为0.2～20.0 ng/mL，所得检测结果如下。

香菇样品中3 种硒代氨基酸的测定见表3，甲基硒代半胱氨酸MRM 谱图见图1，硒代蛋氨酸MRM谱图见图2，硒代半胱氨酸MRM谱图见图3，HPLCESI-MS 法检测3 种硒代氨基酸的回归方程、相关系数和检出限见表4。

图1 甲基硒代半胱氨酸MRM 谱图

图2 硒代蛋氨酸MRM 谱图

图3 硒代半胱氨酸MRM 谱图

表3 香菇样品中3 种硒代氨基酸的测定

表4 HPLC-ESI-MS 法检测3 种硒代氨基酸的回归方程、相关系数和检出限

2.2 重复性试验

针对试验中的仪器HPLC-ESI-MS 和样品前处理分别进行重复性试验。仪器重复性试验中，以质量浓度15 ng/mL 标液进样6 次，保持其余条件不变，得出此质量浓度下平均峰面积和相对标准偏差（RSD）。

前处理重复性试验中，采用酶解提取法对同一样品连续处理6 次，在同样的仪器条件下检测结果，得出平均峰面积和相对标准偏差（RSD）。

HPLC-ESI-MS 仪器和前处理重现性见表5。

表5 HPLC-ESI-MS 仪器和前处理重现性

由表5 可知，3 种氨基酸RSD 值均≤5%，说明仪器方法和前处理方法重现性良好。

2.3 回收试验

3 种硒代氨基酸加标回收率见表6。

表6 3 种硒代氨基酸加标回收率

对样品进行不同质量浓度加标（0.05，0.25，0.50 mg/kg） 3 种硒代氨基酸混标，用酶解提取法做回收试验。各样品平行进样2 次，外标法定量，计算3 个加标水平下3 种硒代氨基酸的回收率和相对标准偏差，得出平均回收率分别为92.3%，93.0%，92.4%；相对标准偏差分别为2.71%，2.14%，1.83%，说明该方法有较高准确度、重现性比较好、方法相对可靠。

3 结论

前处理提取方面，3 种硒代氨基酸在水提取法、酸提取法和酶解提取法的提取效率存在明显差异。因为有机硒在植物中的存在形式比较复杂，主要有游离的氨基酸和蛋白质的形式存在。水提取法主要提取试样中的游离氨基酸；酸提取法能够酸解蛋白质，破坏氨基酸之间的肽键，解离出游离氨基酸，但是高浓度酸解蛋白质过程不可控，可能使蛋白质过度分解，破坏氨基酸之间的肽键，后续可做使用不同浓度酸和不同类型酸提取效果的对比试验。酶解法能够很好地分解蛋白质又不会破坏氨基酸结构，在3 种提取方法中对于提取植物中有机硒效果最有效，具有更高的专一性和更高提取率。酶解法提取耗时比较长，可能存在分解不完全的情况，后续可再进行比对试验，比对不同酶解时长、不同温度、不同蛋白酶及与纤维素酶搭配等的更佳提取方案。

检测仪器选择上，目前使用比较多的是柱前衍生液相色谱法、气相色谱- 串联质谱法、毛细管电泳法和液相色谱- 电感耦合等离子体质谱法等，选择高效液相色谱串联质谱法检测具有灵敏度高、检出限低、抗干扰性强、精密度高、简洁快速等优势，可适用于大批量样品检测，为研究蔬菜中有机硒的检测提供了一定的数据基础。该方法的不足之处在于无法检测样品无机硒和总硒，因此对于硒的形态检测方法还有待进一步的探索和完善。