成都市河流中四环素、喹诺酮类抗生素污染特征及生态风险评价

韩迁，张玉娇，赖承钺，杨璐瑶，孟旭

成都市环境保护科学研究院，四川 成都 610072

抗生素作为一种新型污染物，是目前使用最广泛的药物之一，主要运用于人类和动物的疾病治疗。逐年增长的抗生素生产和销量引发的抗生素滥用现象已不容忽视。2013 年，中国抗生素生产量2.48×105t，使用量为1.62×105t，其中兽用抗生素占52%，人用抗生素占48%，远高于西方国家（Zhang et al.，2015）。由于经人体和动物摄取的抗生素在体内只有部分被代谢，其余高达85%的抗生素则随尿液和粪便、生活垃圾、牲畜和农业废水直接或间接作为母体化合物或代谢物的形式排入城市污水处理厂或土壤，进而排入自然水体，污染废水、地表水和地下水环境中（Wang et al.，2014；Fatta-Kassinos et al.，2011）。因来自环境各媒介的持续输入，加之其在环境中具有持久性或伪持久性的特性，导致不同环境中抗生素的频频检出，尤其是近年来，抗生素在世界各地的废（污）水、地表水、地下水，甚至是饮用水中已经常被检测到（Backhaus et al.，2000；Ashton et al.，2004）。

水中过量的抗生素负担会导致对动物和植物的直接毒性，更重要的是，他们可以诱导耐性抗生素细菌的产生，抗生素的滥用而导致大量耐药性病菌的出现，已经引起了人们对抗生素的广泛关注，加之其具有在不同营养水平的生物体中进行生物累积的潜力（Zhang et al.，2015），残留在水环境中的抗生素通过食物链和食物网对人的健康和水生生物造成潜在风险（Wang et al.，2017）。因成都市人口众多，研究流域流经区域还存在小规模的畜禽散养和水产养殖，加之四环素以及喹诺酮多用于人类疾病和动物养殖，因此本文选取这两类抗生素作为研究对象。四环素类是一种价格低廉，效果极好的广谱抗菌药，是世界使用最广泛的抗生素，因其价格低廉，成为畜禽养殖业使用最多的抗生素；据不完全统计，四环素在世界各国的消耗量已居于各类抗生素之首（Zhang et al.，2015），且过量摄入四环素会严重影响胎儿骨骼生长发育（农业部畜牧兽医局，2003；侯为道等，2004）。喹诺酮类由于具有抗菌谱广和毒副作用小等特点，其使用量在近几年迅速增加，而过量的喹诺酮类抗生素会对非靶生物产生影响进而破坏生态系统的平衡。

成都作为四川省会城市，地处平原，人口密集，水系众多。府河作为长江水系岷江的支流，流经成都市中心，人口众多；西江河以及毗河分属成都市东部和北部，经济发展主要以种植和工业园区为主；濛阳河和蒲江河地处成都市郊区，人口相对稀少，主要以农业种植和畜禽散养为主。因此，在前期研究基础上，结合现场调查，选取受农业种植、畜禽散养和人为活动影响较为突出的5 条流域作为研究对象，并以四环素和喹诺酮两大类共计25 种抗生素作为目标化合物，调查其在不同流域丰水期和枯水期中的抗生素含量，分析其在水环境中的污染特征以及对生态风险水平进行评估，以期了解成都市地表水中抗生素的污染现状和环境危害程度，为成都市水体的环境保护提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

TSQ Quantum Access MAX 液质联用仪（美国，Thermo）、色谱柱（Syncronis C18100 mm×2.1 mm×1.7 μm）（美国，Thermo)、Vac Elut SPS 24 多通道固相萃取装置（美国，Agilent）、HLB 固相萃取小柱（6 mL，500 mg）（美国，Waters）、NDK200-2水浴氮吹仪（上海丙林电子科技有限公司）、玻璃纤维滤膜（0.45 μm，47 mm，上海安谱）。Direct-Q8UV 超纯水仪（德国，Millipore）。

基于抗生素在我国高频率的使用情况，本文选择了26 种抗生素作为监测对象。分别是18 种喹诺酮类：恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）、环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）、西诺沙星（Cinoxacin，CINO）、达诺沙星（Danofloxacin，DAN）、盐酸二氟沙星（Difloxacin hydrochloride，DIF）、依诺沙星（Enoxacin，ENO）、氟罗沙星（Fleroxacin，FLE）、氟甲喹（ Flumequine ， FLU ） 、 洛美沙星（LoMefloxacin，LOM）、马波沙星（Marbofloxacin，MAR）、萘啶酸（Nalidixic acid，NA）、诺氟沙星（Norfloxacin，NOR）、氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）、奥比沙星（Orbifloxacin，ORB）、培氟沙星（Pefloxacin，PEF）、吡哌酸（Pipemidic acid，PPA）、沙氟沙星（Sarafloxacin，SAR）、司氟沙星（Sparfloxacin，SPA）以及内标物盐酸环丙沙星-d8（Ciprofloxacin-d8，CIP-d8）。7 种四环素类：金霉素（ Chlortetracycline ， CTC ） 、 地美环素（demeclocycline，DCTC）、强力霉素（Doxycycline，DC）、美他环素（metacycline，MTC）、4-表脱水四环素（4-epianhydrotetracycline，EATC）、四环素（Tetracycline，TC）、脱水差向四环素（Anhydrotetracycline，ATC）以及内标物四环素-d6（Tetracycline-d6，TC-d6）。所有标准品均购自Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司，纯度大于99%；甲酸、甲醇均为色谱纯（美国，Thermo），乙二胺四乙酸二钠盐（Na2EDTA·2H2O）购自上海安谱实验科技有限公司，所有抗生素标准品均用甲醇稀释定容，置于-20 ℃低温冰箱中避光保存。

1.2 样品采集与预处理

分别于2021 年3 月（枯水期）和2021 年9 月（丰水期），在成都市濛阳河（S1—S7）、毗河（S8—S11）、西江河（S12—S20）、府河（S21—25）以及蒲江河（S26—S31）等5 条小流域设置采样点共计31 个。采样点具体分布位置详见图1。水样均采集表层水面以下0.3—0.5 m 处，置于1 L 棕色玻璃瓶内，同时每个点在同一位置设置一个平行水样，共计62 个水样。于当日运回实验室存于4 ℃冰箱，48 h 内完成前处理。

图1 采样点示意图Figure 1 Schematic diagram of the sampling points

采用0.45 μm 玻璃纤维滤膜对采集的水样进行过滤，以除去水样中大颗粒物质，后加入0.025 g Na2EDTA 和50 ng 的内标。利用Vac Elut SPS 24 真空萃取装置对样品进行富集。先后用10 mL 甲醇、10 mL 超纯水分两次预淋洗活化HLB 小柱，使用抽滤装置控制流速，保持速度在3—5 mL·min-1，直至水样完全通过HLB 柱。萃取结束后，使用抽滤装置继续将HLB 柱抽至完全全干燥，后用10 mL 甲醇对HLB 柱进行洗脱，收集洗脱液于试管中，在30 ℃下将洗脱液氮吹至0.5 mL，再用甲醇定容至1 mL，于-20 ℃低温冰箱保存待测。

1.3 仪器分析条件

采用高效液相-三重四级杆液质联用仪对处理后的样品进行分类测试。色谱条件：流速0.25 mL·min-1；进样量为5 μL；柱温40 ℃。流动相A：体积分数为0.1%的甲酸水溶液。B：纯甲醇。采用的流动相梯度为：0—2 min 20% B，2—8 min 80%B，8—10 min 20% B。质谱条件：采用电喷雾（ESI）离子源正离子模式扫描，多反应离子（MRM）扫描目标化合物；电离电压3 500 V；鞘气压力40 kPa；辅助气压力8 kPa；离子源温度350 ℃。目标化合物信息以及质谱参数见表1。

表1 不同水期抗生素检出率、质量浓度范围以及平均值Table 1 Detection rate, mass concentration range, and average value of antibiotics in different water stages ng·L-1

1.4 方法回收率及精密度

采用内标法定量进行分析，每个点位同时测定其平行水样，且每隔12 个样品对100 μg·L-1的标样进行一次测定，以保证仪器性能的准确性。以目标化合物响应值与内标物CIP-d8、TC-d6 响应值之比作图，得出标准曲线，标准曲线在1—400 μg·L-1，范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.998。另外设置空白、空白加标和基质加标实验，实保证实检测方法的可行性和准确性，采用与水样相同的方法分析空白加标和基质加标样，每个样品设置3个平行，结果显示，25 种抗生素的回收率在60.9%—115%之间，标准偏差RSD 为7.62%—12.7%，以S/N≥3 倍信噪计算方法检出限为0.22—0.41 ng·L-1。

2 结果讨论

2.1 研究区地表水中抗生素的赋存水平

对成都市研究流域中25 种抗生素进行测试，结果表明，研究流域水体中抗生素广泛存在，16 种抗生素均有不同程度的检出（其中四环素类4 种，喹诺酮类12 种），所有抗生素检出浓度水平均处于ng·L-1级。25 种抗生素在不同水期的检出率、浓度范围以及平均值如表1 所示。由表可知，不同种类的抗生素在不同水期的浓度水平存在一定差异，各采样点检出抗生素质量浓度范围介于ND—642 ng·L-1间（ND 表示未检测到），四环素类抗生素的检出质量浓度范围为ND—158 ng·L-1，平均为65.6 ng·L-1，最高的是DC，为25.9—158 ng·L-1，其次是MTC 和TC；喹诺酮类抗生素的检出质量浓度范围在ND—642 ng·L-1之间，平均为245 ng·L-1，最高的是FLE，为31.1—642 ng·L-1，其次是OFL 和MAR。在检测的25 种抗生素中，OFL 和FLE 检出浓度最高，分别高达384 ng·L-1和642 ng·L-1，分别位于毗河流域的S11 以及西江河流域的S15 采样点，且浓度最高值均出现在枯水期。

丰水期中，FLU、TC 和OFL 的检出率均高于60.0%，最高的为FLU，高达90.3%，其次为TC，为87.1%；枯水期中，MTC、TC、FLU 和OFL 的检出率均高于50.0%，TC 检出率最高，为77.4%，其中，OFL、FLU 和TC 在两个水期检出率均比较高，推断采样点附近可能存在持续性的输入来源；其余12 种抗生素的检出率在6.45%—32.3%之间。

2.2 研究区地表水中抗生素的时空分布特征

环境中抗生素的浓度及空间分布特征与其消耗量、使用频率和环境因子等多因素有关。各采样点不同水期抗生素浓度分布如图2 所示。由图2 和表1 可知，丰水期检出率略高于枯水期，枯水期检出率较高的有四环素类的TC（77.4%）和MTC（58.1%），喹诺酮类的OFL 和FLU（54.8%）；而丰水期检出较高的四环素类仅有TC（87.1%），喹诺酮中的FLU 和OFL 在丰水期检出率均较高，分别为90.3%和61.3%。从检出浓度分析，喹诺酮类为两个水期中主要的污染物，枯水期和丰水期的平均质量浓度分别为138 ng·L-1和18.5 ng·L-1；枯水期检出浓度最高的是FLE 和OFL，质量浓度范围分别介于31.1—642 ng·L-1和8.88—384 ng·L-1间；平均质量浓度为245 ng·L-1和73.8 ng·L-1，浓度相对较高的采样点为S15 和S30；丰水期检出浓度最大的是OFL 和DCTC，质量浓度分别介于0.340—141 ng·L-1和3.34—111 ng·L-1之间，平均质量浓度为11.9 ng·L-1和40.2 ng·L-1，浓度相对较高的采样点为S24 和S25。且枯水期浓度远大于丰水期，一方面可能是因为四环素和喹诺酮通常用于牲畜或家禽预防和治疗大多数呼吸道感染和腹泻，在秋季甚至冬季，动物更容易受到这些疾病影响，从而导致使用量增加，另一个方面在丰水期水流量较大，温度较高，会加剧抗生素的迁移和降解速率（Loftin et al.，2008）。结合表1 和图2 分析，喹诺酮类的检出率和检出浓度都略高于四环素类，这是由于喹诺酮类主要用于人类疾病治疗，医疗用量较大（李士俊等，2019），此外，天然水体中的大部分喹诺酮抗生素对水解不敏感且生物降解过程受硝化过程共代谢的影响较大（Van et al.，2014；张亚茹等，2021）；而TCs 类抗生素属于酸碱两性化合物，在酸性或碱性环境中均不稳定（陈亚君，2020；Wang et al.，2019），也有研究发现TCs 类抗生素具有很高的吸附性，尤其在酸性条件下，更容易被颗粒物吸附（Sassman et al.，2005；张晶晶等，2021），使得TCs 类抗生素的检出较喹诺酮低。

抗生素总量在不同水期的累计质量浓度分布如图3 所示，濛阳河（S1—S7）质量浓度范围为ND—68.47 ng·L-1，毗河（S8—S11）为ND—156.7 ng·L-1，西江河（S12—S20）为ND—642.8 ng·L-1，府河（S21—25）为ND—141 ng·L-1以及蒲江河（S26—S31）为ND—384 ng·L-1。研究流域抗生素的分布具有一定的空间差异性，5 条研究流域中抗生素的质量浓度累积依次为西江河＞蒲江河＞府河＞毗河＞濛阳河。

图3 各点位枯水期和丰水期抗生素累计质量浓度分布Figure 3 Accumulated mass concentration distribution of antibiotics at each point

西江河流域累积质量浓度远高于其余流域，该流域S15 为所有点位中累计浓度最高的点位，高达814 ng·L-1，采样点附近存在农业产业园以及少量的汽车零件工业园，同时周围有大面积的农业种植以及个别鱼类养殖，污水通过地表径流入河造成水环境的污染，加之该流域地处成都东部地区，人口密集，主要以汽车产业和农业种植为主，且还存在部分污水收集未完全纳入管网，加之来自上游的累积以及周边环境影响，导致其浓度仅次于西江河；府河流域主要流经成都市主城区，人口众多，抗生素浓度受人为活动影响较大，其中S25 抗生素累计浓度最高，为244 ng·L-1；毗河流域累计浓度最高的点出现在S11，为210 ng·L-1，采样点位于成都市郊区，附近农田较多，加之该区域紧邻主城区，多为乡镇，人口活动较为频繁，沿岸主要以农业种植为主，部分抗生素随雨水冲刷入河；濛阳河相较于其余河流地势较为偏僻，人口稀少，相对应抗生素的使用量也较少，本文检测结果也证实了该判断，该流域最高检测质量浓度为163 ng·L-1，位于S3 点位，此点主要污染来源于农业种植。因此，根据研究结果推测，农业种植、养殖废水和生活污水可能为成都市研究流域中抗生素污染的主要来源，且受人为活动影响较大。

在研究的31 个点位中，仅S31（位于蒲江河）在枯水期中未检测到目标抗生素，此外，其余点位在两个水期均有不同种类的抗生素检出。结合图2可知，丰水期累计浓度最高的点位于府河流域的S24 和S25，分别为155 ng·L-1和115 ng·L-1，贡献最大的抗生素是OFL 和DCTC，贡献率均高达90.0%以上，其余点位相对较低，累计质量浓度均小于20.0 ng·L-1，因府河流域地处成都市人口密集区域，河流流经市区，沿岸多为居民区，部分生活污水收集不完全以及雨水对生活垃圾、地面尘土等面源冲刷，一定程度上导致抗生素浓度的增高（Zhou et al.，2013）。枯水期中位于西江河的S15和蒲江河的S30 累计浓度最大，分别为806 ng·L-1和413 ng·L-1，其中喹诺酮类的FLE 和OFL 为主要的污染物，质量浓度分别为642 ng·L-1和384 ng·L-1，贡献率为79.7%和93.2%，这两种抗生素属于人畜共用药，同时采样点附近乡镇聚集，部分村名围网养殖，向水中投放饲料和抗菌药等，这有可能是因为雨水冲刷把沿岸养殖的抗生素环境残留冲入河流中导致这两种药物的检出浓度较高的原因（Zhou et al.，2013）；蒲江河流域中的S30 为所有点位中累计浓度最小的点，仅为0.810 0 ng·L-1，该点远离乡镇，附近人口活动较少，且无明显农业种植地，抗生素无明显来源途径。

2.3 与国内其他地区河流和湖泊比较

由于大量抗生素通过各种途径不断的进入水体环境，我国众多河流水体中已检测到不同种类抗生素存在，并且质量浓度差异较大。与国内其他地区地表水和湖泊水体抗生素浓度相比（表2），水体中抗生素污染程度最高的河流是北京清河流域（高丽等，2014），为45.3—3.82×103ng·L-1，最低的是赛里木湖（张亚茹等，2021），为ND—32.5 ng·L-1。成都市地表水流域中四环素类抗生素低于我国苏州市水体（杨俊等，2019）、袁河（李佳乐等，2022）以及珠江流域（Li et al.，2018），与黄浦江（Jiang et al.，2011）抗生素检出浓度相当，高于其余对比流域。喹诺酮类抗生素检出浓度低于珠江、青狮谭（莫苑敏等，2019）以及清河流域，远高于浑河（卢正山，2020）以及黄浦江。对比结果表明，不同种类的抗生素在不同水体中的含量分布具有一定的地域性差异，这可能与当地人口数量，经济水平以及环境行为有关（Ma et al.，2015）。成都市研究流域中抗生素的残留水平与国内其他流域水体相较而言，研究流域中四环素类和喹诺酮类抗生素的最高检出浓度均低于国内大部分河流，抗生素浓度水平处于中等水平。

表2 国内不同地区水体中抗生素残留水平Table 2 Antibiotic residue levels in different domestic regions ng·L-1

3 生态风险评价

对于抗生素的污染浓度，目前还没有一个环境标准来进行规范，本文研究参照欧洲技术委员会的指导文件（EC，2003）。风险熵值（risk quotient，RQ）可用于评价水环境中抗生素的潜在风险水平。风险熵值通常是由药物残留的预测环境浓度（MEC）和预测无影响浓度（PNEC）的比值来确定。计算公式详见式 (1)、式 (2)和式 (3)。

式中：

ρm(measured environmental concentration)——实际测定浓度；

ρn(predicted no effectconcentration，PNEC)——无效应浓度，ng·L-1；

ρLC,50(median lethal concentration，LC50)——半数致死浓度，ng·L-1；

ρEC,50(median effective concentration，EC50)——半数有效浓度，ng·L-1；

fa(assessment factors，AF)——评价因子。

为了方便计算。其中PNEC 值通过已发表文献获得（Park et al.，2008；Benoǐt et al.，2009；Luo et al.，2011；Ma et al.，2015；赵腾辉等，2016；Liu et al.，2018；赵富强等，2021）。根据查阅到的毒性数据，对选取的成都市地表水流域中比较有代表性的9 种抗生素进行环境风险评估，毒性数据详见表3。通过急性毒性值LC50和EC50与评估因子AF 来计算,通常AF 取1 000。当RQ≥1，存在高风险，即污染物暴露会给水体生态环境带来危害；当0.1≤RQ＜1，存在中风险，即污染物暴露会对水体生态环境带来潜在危害；当RQ＜0.1，存在低风险，即污染物浓度对水体生态环境无害。

表3 9 种目标抗生素的ρn值Table 3 The ρn values of the nine target antibiotics

尽管抗生素对鱼类等较高等动物来说处于低风险水平，但对一些低等生物来说却具有较高的风险，而且抗生素低剂量长期暴露在水体环境中，可使这些生物产生耐药性，进而影响抗生素对人类的治疗效果,所以对水环境中抗生素的生态风险评价就显得十分重要。据文献报道（Cleuvers，2003，2004），当多种抗生素共同存在于水环境中时，抗生素之间可能存在协同作用以增加对环境的生态风险。因此，本研究采用叠加模型计算其毒性风险熵（RQsum)（Quinn et al.，2008），以此反映不同流域抗生素残留对环境的的生态风险情况。研究流域丰水期和枯水期的风险熵结果详见表4 和表5。

表4 丰水期研究流域水体中抗生素风险熵Table 4 Antibiotic risk entropy in water waterments

表5 枯水期研究流域水体中抗生素风险熵Table 5 Antibiotic risk entropy in water basin

濛阳河流域水体中，9 种抗生素丰水期的RQ均低于0.1，无明显生态风险水平；枯水期中DC 和ENR 抗生素的RQ 高于0.1 但低于1，处于中等风险水平，LOM 和NOR 抗生素的RQ 均大于1，对生态环境存在较高的危害。毗河流域水体中仅OFL在枯水期表现为中等风险水平，其余抗生素RQ 均低于0.1，表现为无明显生态风险水平。西江河流域中，抗生素仅在枯水期表现生态风险，其中DC、ENR 和OFL 抗生素RQ 高于0.1，LOM 和NOR 抗生素的RQ 均大于1，对生态环境存在危害风险。锦江流域水体中仅OFL 和DC 分别在丰水期和枯水期RQ 高于0.1，处于中风险水平，其余抗生素对水体均表现为无风险。蒲江河流域水体中，丰水期抗生素对水环境无生态风险，但OFL 和DC 的RQ 高于0.1 以上，处于中高风险水平，对水体环境存在较高程度的危害。

从风险熵叠加结果RQsum可以看出，不同水期水环境中残留的抗生素对流域生态环境的危害有所差异，枯水期加和风险值远高于丰水期，对水体存在高风险危害。濛阳河、西江河和蒲江河流域较其余两条流域的叠加风险水平高，其RQsum均高于1.5 以上，尤其是西江河及濛阳河，RQsum高达4.50，对生态环境存在较高的危害，应该引起重视。

3 结论

1）通过两个水期的采样，成都市研究流域中共检出16 种抗生素，质量浓度介于ND—642 ng·L-1间，检出率在0—90.3%之间；丰水期检出率最高的是FLU 和TC，分别为90.3%和87.1%；枯水期检出最高为四环素，为77.4%。

2）时空分布结果显示，枯水期累积浓度远高于丰水期。在研究的25 种抗生素中，OFL 在两个水期中贡献率均比较大，占比均高于90%。其中位于西江河流域的S15 为所有研究流域中累计浓度最大的点，质量浓度高达814 ng·L-1，最小的点也位于该流域，仅0.810 ng·L-1。研究结果显示，整体上，抗生素的浓度随着不同水期、不同地域和采样点周围环境的变化存在一定的差异性，人口密集、农业种植较为广泛的采样点抗生素的残留浓度显著高于无明显人为活动地区的污染浓度，由此反映出研究流域中抗生素的污染主要受人为活动和农业种植影响较大。与国内其他水体比较，成都市研究流域中抗生素残留水平处于中等水平。

3）枯水期生态风险高于丰水期，枯水期LOM和NOR 在濛阳河及西江河流域、DC 在蒲江河流域中的RQ 均大于1，抗生素加和风险RQ≥0.1，持中高风险水平。这表明成都市研究流域中抗生素的使用较为普遍且对生态环境存在一定的潜在危害，因此，应适当采取措施控制水环境抗生素污染。但是，目前国内对于抗生素的使用和排放的监管还没有明确的法规，因此，成都市地区的地表水抗生素的检出所反映出的水环境安全问题需要持续关注。