茉莉酸甲酯和酵母提取物对白鲜试管无菌苗生长和药用成分含量的影响

杜佳霖 董 睿 李辛琲 王 威 孙艺文 马 越 南桂仙

（延边大学农学院，吉林 延吉 133002）

白鲜（DictamnusdasycarpusTurcz.）属芸香科白鲜属多年生宿根草本植物［1］，其根部可入药。白鲜根部经过脱水等一系列干燥措施后即得白鲜皮，白鲜皮是我国重要的中药材之一。白鲜的主要化学成分包括生物碱、柠檬苦素类、黄酮类等［2］，常用于治疗湿热疮毒、黄水淋漓、湿疹、风疹等疾病［3］。随着对白鲜的深入研究，白鲜皮还有抗炎、抗真菌、止血、抗癌等药理作用［4］。由于白鲜具有重要的药用价值，导致人们对野生白鲜的过度开采，现有野生白鲜数量已经不能满足人们的需求，如何合理开发和保护药用植物并提升其次生代谢产物的含量是目前面临的一项挑战。

诱导子处理能够有效提升药用植物次生代谢产物含量，利用诱导子促进次生代谢产物积累成为当前研究热点［5］。诱导子可分为生物诱导子与非生物诱导子两种类型［6］。茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、酵母提取物（yeast extract，YE）作为常用的诱导子，已被成功应用于多种药用植物中以促进其生长和提升自身次生代谢产物含量［5，7］。但对于白鲜而言，尚鲜有相关报道。

鉴于此，本试验以白鲜为研究对象，初步探究不同浓度MeJA、YE 处理对白鲜生长及其次生代谢产物的影响，并采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定白鲜中的白鲜碱、梣酮、黄柏酮含量，以期为药用植物白鲜次生代谢产物的生物合成奠定理论和实践基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 本试验的植物材料为白鲜种子，采收于安图白鲜栽培地。

1.1.2 试验仪器、药品 仪器：1260 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；SB-120D 超声波清洗机，宁波新芝生物科技有限公司；SW-CJ-1FD 超净工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司；YXQ-LS-50 高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司。药品：乙醇、蔗糖，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）、MeJA，上海麦克林生化科技股份有限公司；蒸馏水、无菌水、超纯水、MS 培养基粉，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司；1 mol·L-1氢氧化钠、1 mol·L-1盐酸、2%次氯酸钠（NaClO）、15%过氧化氢（H2O2）、YE，上海赛默飞世尔科技公司；白鲜碱标准品、黄柏酮标准品、梣酮标准品，上海源叶生物科技有限公司。无特殊标记外的试剂均为分析纯。

1.2 试验设计和实施

1.2.1 试验设计 将消毒后的白鲜种子点在MS 培养基中，待种子发芽后分别移到添加不同浓度诱导子的MS 培养基中培养，浓度分别为MeJA 0.1、0.5、1、5、10、50 µmol·L-1；YE 10、30、50、100、200、300 mg·L-1，以不加诱导子的MS 培养基为对照（CK），每个培养基点10粒种子，每个处理重复3次，培养30 d后观察白鲜幼苗生长情况。培养温度（24±1）℃，光照时间14 h。

1.2.2 试验的实施 1）种子的消毒处理：参考樊宪伟［8］的方法对种子进行消毒；2）基础培养基的选择：参照贾晓龙［9］的试验结果，本试验采用MS培养基为基本培养基；3）待测样品的制备：将植物样品放入烘箱55 ℃烘干3～4 h，温度提高到100 ℃烘干1～2 h，冷却后研磨，取1.0 g 样品，放入锥形瓶中，加入甲醇25 mL，加热回流1 h，水浴温度60 ℃，冷却取混合液补充少量甲醇并通过0.22 µm 微孔过滤，即得样品待测液。每个处理重复3次。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 根长与侧根数 在同一浓度处理下选取白鲜幼苗20 个，用刻度尺测量白鲜幼苗根长并记录白鲜幼苗的侧根数量。上述每个处理重复4次。

1.3.2 鲜重净增量与干重净增量 利用分析天平称量10 粒白鲜种子的重量（M1），在同一浓度处理下选取10个白鲜幼苗并称量其总重量（M2），鲜重净增量（mg）=M2-M1。将上述植物材料于55 ℃烘干3～4 h，温度提高到100 ℃烘干1～2 h，烘干后白鲜种子的总重量记为M3，烘干后白鲜幼苗的总重量记为M4，干重净增量（mg）=M4-M3。

1.3.3 药用成分的检测 本试验采用加热回流装置和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测白鲜中的白鲜碱、梣酮、黄柏酮含量。检测方法与色谱条件参考贾晓龙［9］的试验方法并计算回归方程，白鲜碱、梣酮、黄柏酮的标准品质量浓度对峰面积的回归方程分别为：

y=134.69x-23.259 (R2=0.999 8)

y=24.331x+74.98 (R2=0.999 1)

y=21.91x+11.139 (R2=0.999 5)。

1.3.4 精密度试验 分别取0.1 mg·mL-1的白鲜碱、梣酮、黄柏酮标准品母液，在1.3.3的色谱条件下，连续进样5 次进行检测，白鲜、梣酮、黄柏酮的峰面积平均值分别为1 348 416.667、1 001 977.560、1 999 289.333，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.67%、1.59%、1.38%，均小于2%，说明精密度好，符合分析要求。

1.3.5 重复性试验 称取同一浓度处理的白鲜幼苗，按照1.2.2节流程制作供试样品溶液，在1.3.3节色谱条件下，连续进样5 次，结果表明供试样品中白鲜碱、梣酮、黄柏酮含量的RSD 分别为0.50%、0.70%、0.70%，均小于2%，表明重复性很稳定，符合分析的要求。

1.4 数据处理

首先使用Microsoft Excel 2007 进行数据汇总，然后利用SPSS 26 统计软件对试验数据进行单因素方差分析（one way ANOVA）和主成分分析，最后用GraphPad 9软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度MeJA 对白鲜生长及药用成分含量的影响

2.1.1 不同浓度MeJA 对白鲜生长的影响 由图1可知，随着MeJA 浓度的增加，白鲜幼苗根长和侧根数呈现先上升后下降的趋势，均在1 µmol·L-1达到最大值，最大根长为3.18 cm，最大侧根数为1.55 条，从10 µmol·L-1浓度开始显著抑制了根部的生长。

图1 不同浓度茉莉酸甲酯处理的白鲜幼苗根长和侧根数Fig.1 Root length and lateral root number of Dictamnus seedlings treated with different concentrations of methyl jasmonate

由表1可知，不同浓度MeJA处理白鲜幼苗鲜重净增量和干重净增量有所差异，均随MeJA浓度的增加呈现先上升后下降趋势。MeJA浓度在1 µmol·L-1时，鲜重净增量达到最大值，为1 060.96 mg，当浓度为10 µmol·L-1时，幼苗鲜重净增量开始显著低于CK。MeJA 浓度为1 µmol·L-1时幼苗干重净增量最大，为164.60 mg，在浓度达到50 µmol·L-1时幼苗干重净增量显著低于CK。

表1 不同浓度茉莉酸甲酯处理后的白鲜幼苗鲜重净增量和干重净增量Table 1 Net fresh weight increment and net dry weight increment of Dictamnus seedlings treated with different concentrations of methyl jasmonate/mg

2.1.2 不同浓度MeJA对白鲜药用成分含量的影响 由图2 可知，不同浓度MeJA 处理白鲜幼苗中的3 种药用成分含量整体差异显著。3种药用成分含量均随MeJA浓度的增加呈现先上升后下降趋势。除50 µmol·L-1外，其他浓度处理白鲜碱含量均显著高于CK。5 µmol·L-1时白鲜碱含量达到最大值，为316.81 µg·g-1。梣酮含量在0.1 µmol·L-1MeJA处理后达到最大值，为518.38 µg·g-1，其次是0.5 µmol·L-1，含量为344.62 µg·g-1。黄柏酮含量在MeJA 浓度为5 µmol·L-1时达到最大值，为246.81 µg·g-1，MeJA 各处理中黄柏酮的含量都显著高于CK。

图2 不同浓度茉莉酸甲酯处理的白鲜三种药用成分含量Fig.2 Contents of three medicinal components of Dictamnus treated with different concentrations of methyl jasmonate

2.1.3 不同浓度MeJA 对白鲜生长和药用成分含量的主成分分析 以不同浓度MeJA 处理后白鲜幼苗根长、侧根数、生物量和三种药用成分含量共7个指标进行主成分分析，通过综合评价筛选出MeJA 的最佳浓度。将数据进行标准化处理，计算相关矩阵的特征值和所对应的特征向量。结果表明（表2），前两项综合指数的特征值＞1，累积贡献率为85.923%，可代表原来所有指标的绝大部分信息。主成分1主要综合了根长（载荷0.947，下同）、侧根数（0.979）、鲜重净增量（0.919）、干重净增量（0.925）和梣酮含量（0.509），代表原始数据信息量的54.776%，主成分2 主要综合了白鲜碱含量（0.945）和黄柏酮含量（0.971），代表原始数据信息量的31.147%。

表2 相关矩阵特征值和特征向量Table 2 Eigenvalues and eigenvectors of correlation matrix

用各指标变量的主成分载荷除以特征值的算术平方根，可得到2 个主成分中每个指标对应的特征向量。以每个指标的特征向量为权重构建函数表达式并计算2 个主成分的得分F1、F2。再将2 个主成分的方差贡献率分别作为权重，计算不同浓度MeJA 处理下白鲜幼苗的综合得分F。

F=54.776% F1+31.147% F2

由MeJA 所有浓度处理后的综合得分排名可知（表3），MeJA 最佳处理浓度为1 µmol·L-1，其次是0.5、5 µmol·L-1。

表3 茉莉酸甲酯各浓度主成分得分及综合排名Table 3 Principal component scores and comprehensive ranking of methyl jasmonate concentration

2.2 不同浓度YE对白鲜生长及药用成分含量的影响

2.2.1 不同浓度YE 对白鲜生长的影响 由图3 可知，不同浓度YE 处理后的白鲜幼苗根长和侧根数整体差异显著，YE 30 mg·L-1处理明显促进了白鲜幼苗根的生长，长度为5.12 cm，YE 300 mg·L-1处理显著抑制了白鲜幼苗根的生长（图3-A）。YE 浓度达到30 mg·L-1时，侧根数最多，为3.29 条。除YE 浓度300 mg·L-1时的白鲜幼苗侧根数（0.93 条）少于CK 外，其他浓度处理下的侧根数均多于CK（图3-B）。

图3 不同浓度酵母提取物处理后白鲜幼苗的根长和侧根数Fig.3 Root length and lateral root number of Dictamnus seedlings treated with different concentrations of yeast extract

由表4可知，不同浓度YE 处理白鲜幼苗鲜重和干重净增量有所差异。白鲜幼苗的鲜重净增量和干重净增量均随YE 浓度的增加呈现先增加后减少的趋势，两者均在YE 浓度为30 mg·L-1时达到最高值，之后开始缓慢减少，到300 mg·L-1时最低，但较CK 无显著差异。幼苗鲜重净增量最大值为1 832.63 mg。YE 浓度在10 和30 mg·L-1时的幼苗干重净增量显著高于CK，分别为154.60和162.77 mg，300 mg·L-1时的干重净增量低于CK，为111.90 mg，但无显著差异。

表4 不同浓度酵母提取物处理后的白鲜幼苗鲜重净增量和干重净增量Table 4 Net increment of fresh weight and net increment of dry weight of Dictamnus seedlings treated with different concentrations of yeast extract/mg

2.2.2 不同浓度酵母提取物对白鲜药用成分含量的影响 由图4 可知，不同浓度YE 处理整体显著提高了白鲜中三种药用成分含量，均随着YE 浓度的增加整体呈现先上升后下降的趋势。

图4 不同浓度酵母提取物处理的白鲜药用成分含量Fig.4 Content of medicinal components of Dictamnus treated with different concentrations of yeast extract

白鲜碱含量在YE 浓度为10 mg·L-1时最高，为301.58 µg·g-1，其次是30、50 mg·L-1，分别为280.77、264.12 µg·g-1。YE 浓度10～100 mg·L-1范围内，梣酮含量随浓度的增加呈显著上升趋势，在100 mg·L-1时达到最大值，为301.63 µg·g-1，200 mg·L-1时开始下降。在YE 30 mg·L-1浓度处理时黄柏酮含量最高，为218.49 µg·g-1，300 mg·L-1时的黄柏酮含量较低，为178.89 µg·g-1。

2.2.3 不同浓度YE对白鲜生长和药用成分含量的主成分分析 以不同浓度YE 处理后的白鲜幼苗根长、侧根数、生物量和三种药用成分含量共7个指标进行主成分分析，通过综合评价筛选出YE的最佳浓度。将上述各项指标的数据经标准化处理后，计算相关矩阵的特征值和所对应的特征向量。结果表明（表5），前两项综合指数的特征值＞1，累积方差贡献率为91.428%，可代表原来所有指标的绝大部分信息。主成分1 主要综合了根长（0.919）、侧根数（0.910）、鲜重净增量（0.936）、干重净增量（0.900）、白鲜碱含量（0.881）和黄柏酮含量（0.786），代表原始数据信息量的71.299%，主成分2为梣酮含量（0.821），代表原始数据信息量的20.129%。

表5 相关矩阵特征值和特征向量Table 5 Eigenvalues and eigenvectors of correlation matrix

用各指标变量的主成分载荷除以特征值的算术平方根，可得到2 个主成分中每个指标对应的特征向量。以每个指标的特征向量为权重构建函数表达式并计算2个主成分的得分F1、F2。再将2个主成分的方差贡献率分别作为权重，计算不同浓度YE 处理下的白鲜幼苗综合得分F：

F=71.299% F1+20.129% F2

由YE所有浓度处理后的综合得分排名可知（表6），YE最佳处理浓度为30 mg·L-1，其次是10、50 mg·L-1。

表6 酵母提取物各浓度主成分得分及综合排名Table 6 Principal component scores and comprehensive ranking of yeast extract concentration

2.3 不同诱导子处理对白鲜幼苗生长和药用成分的主成分分析

以两种不同浓度诱导子处理后的白鲜幼苗根长、侧根数、生物量和三种药用成分含量共7 个指标进行主成分分析，通过综合评价筛选出最佳诱导子。将上述各项指标的数据经标准化处理后，计算相关矩阵的特征值和所对应的特征向量。结果表明（表7），前两项综合指数的特征值＞1，累积方差贡献率为83.866%，可代表原来所有指标的绝大部分信息。主成分1 主要综合了根长（0.943）、侧根数（0.930）、鲜重净增量（0.949）、干重净增量（0.883）、白鲜碱含量（0.684）和梣酮含量（0.234），代表原始数据信息量的59.625%，主成分2主要为黄柏酮含量（0.822），代表原始数据信息量的24.241%。

表7 相关矩阵特征值和特征向量Table 7 Eigenvalues and eigenvectors of correlation matrix

用各指标变量的主成分载荷除以特征值的算术平方根，可得到2 个主成分中每个指标对应的特征向量。以每个指标的特征向量为权重构建函数表达式并计算2 个主成分的得分F1、F2。再将2 个主成分的方差贡献率分别作为权重，计算不同浓度诱导子处理下的白鲜幼苗综合得分F：

F=59.625% F1+24.241% F2

由两种诱导子所有浓度处理后的综合得分排名可知（表8），两种诱导子处理白鲜幼苗的最佳处理诱导子以及最佳浓度为YE 30 mg·L-1，其次是YE 10 mg·L-1。

表8 两种诱导子各浓度主成分得分及综合排名Table 8 Principal component scores and comprehensive ranking of two elicitors at each concentration

3 讨论

MeJA是一种普遍存在于植物界的信号调控物质［10］，是天然存在于植物内的内源性生长调节剂［11］，可以参与调控植物生长发育中的各个过程［12］。MeJA 能诱导植物的种子萌发，根、茎的生长，细胞分裂、形态发育等反应［13］；增加过氧化物酶、壳聚糖酶和脂氧合酶等蛋白活性，对生物碱等次生代谢产物有促进作用［14］；增强并改变挥发性信号化合物的释放，乃至产生防御结构。利用MeJA 诱导药用植物中活性成分受到广泛关注，研究表明，MeJA 可提高宁夏枸杞的抗氧化酶活性、抗病性，提高总酚和类黄酮的积累［15］，促进牛膝、膜荚黄芪、高山红景天等药用植物药用成分［16-19］及黄连幼苗和钩藤中生物碱含量的增加［20-21］。本研究结果与上述研究结果相似。即MeJA 对白鲜生长和药用成分含量有显著影响，初步证明了适宜浓度的MeJA 可促进药用植物白鲜生长并提高其主要药用成分含量。浓度为1 µmol·L-1时，白鲜幼苗的根长、侧根数、鲜重净增量和干重净增量较CK 提升最为明显，当MeJA 浓度在5 µmol·L-1时，白鲜中白鲜碱和黄柏酮含量达到最大值，0.1 µmol·L-1时的梣酮含量最高。

YE是以酵母为原材料，采用现代分离提纯技术得到的纯天然制品［22］。YE 是一种生物诱导子，已被国内外研究广泛运用［23］。本试验结果表明，YE 对白鲜生长和药用成分含量有明显影响，初步证明了适宜浓度的YE 可促进白鲜生长并提高其主要药用成分含量。在30 mg·L-1时，白鲜幼苗的根长、侧根数、鲜重净增量和干重净增量均达到最大值，白鲜碱、黄柏酮、梣酮含量分别在10、30、100 mg·L-1时达到最大值。YE在植物体内的作用表现在调控次生代谢过程，究其原因，YE 可促进生物酶合成或调节酶活性，使得次级代谢产物合成加速，积累量有显著增加［22，24］。YE 也可以缓解生物和非生物胁迫，促进植物生长［25］。前人研究表明，适宜浓度YE 能促进蜀葵不定根［26］、羽扇豆苗的长度和幼叶鲜重［7］、人参和西洋参愈伤组织的生长［27］；YE 还可以提高绞股蓝毛状根生长量和颠茄毛状根中的生物碱含量［22，28］。本试验结果与上述研究结果相似。

主成分分析是将多个指标或变量近似的转化为少数几个不相关的综合指标的多元统计分析方法，其优点在于可消除评价指标之间的相关影响和减少选择指标的工作量。主成分分析中各主成分是按方差大小依次排序的，在分析问题时舍弃一部分方差小的主成分，只取前几个方差大的主成分来代表原变量。本试验通过主成分分析筛选出综合白鲜幼苗根长、侧根数、生物量以及三种药用成分的MeJA 和YE 最适浓度。在MeJA 处理中共提取出的2 个主成分的累积方差贡献率为85.923%（特征值＞1），主成分1和主成分2分别代表原始数据信息量的54.776%和31.147%，可代表原来所有指标的绝大部分信息。根据综合得分排名可知，1 µmol·L-1MeJA 排名第一，这说明在MeJA 所设浓度中，综合7 项指标，以1 µmol·L-1处理下白鲜幼苗生长和三种药用成分含量提升效果最佳。在YE 处理中共提取出的2 个主成分的累积方差贡献率为91.428%（特征值＞1），主成分1 和主成分2 分别代表原始数据信息量的71.299%和20.129%，可代表原来所有指标的绝大部分信息。根据综合得分排名可知，30 mg·L-1YE 排名第一，这说明在所设浓度中，结合7 项指标，30 mg·L-1YE 处理对白鲜幼苗的生长和三种药用成分含量提升效果最佳。通过对MeJA和YE的横向比较的排名顺序发现，30 mg·L-1YE 综合排名第一，从而得出结论，两种诱导子处理后的最佳诱导子及其浓度为30 mg·L-1YE。

4 结论

本试验初步证明了MeJA 和YE 对白鲜幼苗生长和提升药用成分含量有较为明显的影响，不同浓度诱导子处理下的白鲜幼苗生长情况和三种药用成分含量均有所差异。其中白鲜幼苗在MeJA 1 µmol·L-1处理下的根长、侧根数、鲜重净增量和干重净增量达到最大值，分别为3.18 cm、1.02 条、1 660.96 和164.60 mg；5 µmol·L-1时白鲜中白鲜碱和黄柏酮含量达到最大值，分别为316.81和246.81 µg·g-1；0.1 µmol·L-1时梣酮含量最多，为518.38 µg·g-1。对YE而言，30 mg·L-1处理下根长、侧根数、鲜重净增量和干重净增量达到最大值，分别为5.12 cm、3.29条、1 832.63和162.77 mg；10 mg·L-1时白鲜碱含量最高，为301.58 µg·g-1，100 mg·L-1时梣酮含量达到最大值，为301.63 µg·g-1，30 mg·L-1黄柏酮含量最高，为218.49 µg·g-1。因此生产者可根据实际需要选择适合的诱导子浓度。主成分分析结果表明，MeJA 处理的最佳浓度为1 µmol·L-1，YE 处理的最佳浓度为30 mg·L-1，以YE 浓度30 mg·L-1效果最佳。