miR-27a-3p靶向Rnd3对氧糖剥夺/复氧诱导的神经细胞凋亡的影响

李俊杰 白文娅 陈文栋 杨伟 邵建林

昆明医科大学第一附属医院麻醉科（昆明 650032）

脑缺血-再灌注损伤（cerebral ischemia reperfu⁃sion injury，CI-RI）是发生于缺血性脑卒中后由于血流再灌注所致的一种继发性脑损伤。CI-RI 发病机制复杂，涉及多种病理机制，如炎症反应、氧化损伤、胞内钙离子超载、线粒体功能障碍和神经元凋亡等［1-3］。其中，神经细胞凋亡已被证实是再灌注早期加重缺血部位脑组织损伤的主要因素之一［4］。MicroRNAs（miRNAs）是一类能特异性地与mRNA的3'-非翻译区结合发挥转录调控作用的内源性单链非编码RNA，参与调控CI-RI所致的氧化损伤、血脑屏障破坏、细胞凋亡等病理过程［5］。前期研究的测序及验证结果［6］发现，miR-27a-3p在缺血-再灌注损伤的大鼠脑组织中表达下调，生物信息学预测发现Rho家族GTP酶3（Rnd3）可能为其下游的靶基因，且Rnd3在缺血脑组织中表达上调。然而，miR-27a-3p 能否通过调控Rnd3 参与CI-RI 的病理过程目前尚未有研究报道。因此，本研究拟通过体外实验探讨miR-27a-3p 能否通过靶向调控Rnd3 的表达参与大鼠PC12神经细胞的OGD/R损伤过程。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 PC12 神经细胞株和293 T细胞株购自中国科学院昆明动物研究所；DMEM高糖培养基和胎牛血清（FBS）购自美国HyClone公司；CCK-8 试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所；miR-27a-3p、Rnd3、U6 和GAPDH 引物购自北京擎科生物公司；miRNA 和mRNA 逆转录试剂盒购自美国GeneCopoeia 生物公司；慢病毒购自上海吉凯基因科技公司；miR-27a-3p Mimic、miR-27a-3p Inhibitor 及其相应阴性对照的载体质粒、Rnd3 干扰片段和荧光素酶相关质粒均购自广州复能基因有限公司；AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD 公司；Cleaved-Caspase-3（C-caspase-3）抗体购自美国CST 公司；Bax 和β-Actin 抗体购自英国Abcam 公司；Bcl-2 抗体购自美国GeneTex 公司；HRP 标记的第二抗购自美国Sigma 公司；ECL显影液购自美国Thermo Fisher 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及OGD/R 模型制备 PC12 细胞复苏后以104个/孔的密度接种于96 孔细胞培养板中，在添加有10% FBS 的高糖DMEM 培养基中进行培养。每2 d 换1 次液，培养箱环境为95%空气+ 5% CO2，温度为37 ℃。培养7 d 后，PC12 细胞用于后续实验。将293 T 细胞接种于添加10%FBS 的DMEM 完全培养液中培养，用于双荧光素酶报告基因实验。根据先前报道的方法［7］，将PC12 细胞接种于无糖培养基中，在37 ℃低氧（1%O2+ 94% N2+ 5% CO2）的培养箱中培养2 h，之后将培养基更换为正常培养基，于37 ℃两气培养箱（95%空气+5%CO2）中继续培养后制备OGD/R模型。

1.2.2 最适复氧时间点的筛选 取对数期生长的细胞，接种于96 孔板，随机分为对照组（Control，正常培养）、氧糖剥夺2 h 分别复氧3、6、9 和12 h 的OGD/R 模型组，每组3 复孔，分别检测各时间点的细胞活力，胞内miR-27a-3p 和Rnd3 mRNA 的表达，选择合适的复氧时间点继续后续实验。

1.2.3 细胞转染和实验分组 将PC12 细胞按104个/孔的密度接种于96 孔板，当细胞融合度达到80%后，按照生产商说明书，将包装有miR-27a-3p Mimic、miR-27a-3p Inhibitor及其相应阴性对照（miR-27a-3p Mimic-NC 和miR-27a-3p Inhibitor-NC）、Rnd3干扰片段（shRnd3）及其阴性对照（shRnd3-NC）的载体慢病毒对PC12 细胞进行转染，转染72 h 后制备OGD/R 模型。根据实验需求，每组3 复孔，分为Control 组（正常培养的细胞）、OGD/R 组（制备OGD/R 模型）、Mimic-NC 组（转染miR-27a-3p Mimic-NC 后制备OGD/R 模型）、Mimic 组（转染miR-27a-3p Mimic 后制备OGD/R 模型）、Inhibitor-NC 组（转染miR-27a-3p Inhibitor-NC 后制备OGD/R模型）、Inhibitor组（转染miR-27a-3p Inhibitor后制备OGD/R 模型）、shRnd3-NC 组（转染shRnd3-NC 后制备OGD/R 模型）、shRnd3 组（转染shRnd3 后制备OGD/R 模型）和shRnd3+Inhibitor 组（共转染shRnd3和miR-27a-3p Inhibitor 后制备OGD/R 模型）。

1.2.4 CCK⁃8 法检测细胞活力 在各组每孔细胞中加入10 μL 的 CCK-8 溶液，37 ℃孵育1 h 后用酶标仪测定450 nm 的吸光度。细胞活力计算公式为：细胞活力=（实验细胞孔OD450值-空白细胞孔OD450值）/（正常细胞孔OD450值-空白细胞孔OD450值）×100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 Annexin VFITC/PI 试剂盒用于检测细胞的凋亡。收获104个细胞后，每孔分别加入5 μL 的Annexin V-FITC 和10 μL 的PI 试剂溶液后进行避光反应，持续15 min入400 μL 1×的PBS 缓冲液后，在流式细胞仪上检测细胞凋亡。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验验证miR⁃27a⁃3p和Rnd3 的靶向关系 利用TargetScan 数据库预测miR-27a-3p 与Rnd3 的结合区域和位点。分别构建Rnd3 3'-UTR 野生型（Rnd3/Wt）和突变型（Rnd3/Mut）的质粒，并将其分别与miR-27a-3p Mimic-NC（NC）和miR-27a-3p Mimic（Mimic）利用脂质体2000共转染入293 T 细胞，利用双荧光素酶基因报告系统于48 h 后对海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶活性进行测定。以萤火虫荧光素酶为对照，计算荧光素酶的相对酶活性。

1.2.7 RT⁃qPCR 检测细胞内miR⁃27a⁃3p 和Rnd3 mRNA 的表达 TRIzol 法提取细胞内的总RNA，利用试剂盒将RNA 逆转录合成cDNA，然后进行RT-qPCR 扩增。miR-27a-3p 上游引物：5′-TTCA⁃CAGTGGCTAAGTTCCGC-3′，下游引物：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；Rnd3上游引物：5′-GCAAGATAGTAGTGGTGGGCG-3′，下游引物：5′-TCTGGGTAAGAGAGGGGACGG-3′；U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH 上游引物：5′-CAAGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物5′-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-3′。采用2-△△Ct法计算miR-27a-3p 和Rnd3 分别相对于各自内参基因的表达量。

1.2.8 Western blot 检测细胞内Rnd3 和凋亡相关分子的蛋白表达 利用RIPA 裂解液裂解和提取各组细胞中的总蛋白后测定蛋白浓度。经电泳分离，转膜和封闭处理后分别加入Rnd3（1∶100）、Cleaved-caspase-3（1∶500）、Bax（1∶200）、Bcl-2（1∶100）和β-actin（1∶500）的第一抗体4 °C 孵育过夜。TBST 洗膜后加入HRP 标记的第二抗体37 °C 孵育1 h，ECL 显影后采集图像分析灰度值和计算各蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0 统计分析软件进行数据分析，结果以均数±标准差表示。多组比较采用单因素方差分析并进行Tukey 事后检验，以P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复氧不同时刻细胞的活力和胞内miR⁃27a⁃3p、Rnd3 mRNA 的表达 与Control 组比较，复氧后6、9 和12 h 时细胞的活力、miR-27a-3p 的表达水平均明显降低（P< 0.05），12 h 最低；Rnd3 mRNA表达水平在3、6 和12 h 时均明显升高（P< 0.05），12 h 时表达最高，在9 h 时表达无明显变化；因此，选择复氧12 h 进行后续实验，见表1。

表1 复氧不同时刻细胞的活力和胞内miR-27a-3p、Rnd3 mRNA 的表达Tab.1 Cell viability and the expression of miR-27a-3p and Rnd3 mRNA at different time of reoxygenation ±s

表1 复氧不同时刻细胞的活力和胞内miR-27a-3p、Rnd3 mRNA 的表达Tab.1 Cell viability and the expression of miR-27a-3p and Rnd3 mRNA at different time of reoxygenation ±s

注：与Control组比较，*P < 0.05

组别Control组复氧3 h组复氧6 h组复氧9 h组复氧12 h组F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.10 2.56 ± 0.14*2.59 ± 0.08*1.36 ± 0.04 5.85 ± 0.14*323.10< 0.001细胞的活力（%）100.00 ± 2.27 90.46 ± 3.83 66.30 ± 2.61*76.80 ± 3.18*62.66 ± 2.82*28.08< 0.001 miR-27a-3p 1.01 ± 0.08 0.45 ± 0.01*0.31 ± 0.02*0.49 ± 0.02*0.08 ± 0.01*79.10< 0.001

2.2 上调miR⁃27a⁃3p 和下调miR⁃27a⁃3p 对OGD/R 损伤细胞的活力、胞内凋亡相关蛋白的表达和细胞总凋亡率的影响 与Control 组比较，OGD/R组PC12 细胞内miR-27a-3p 的表达下调、细胞的活力降低、C-caspase-3 和Bax 的蛋白表达升高、Bcl-2蛋白表达降低、细胞的总凋亡率增加（P< 0.05）；与Mimic-NC 组比较，Mimic 组细胞内miR-27a-3p的表达上调、细胞的活力增加、C-caspase-3 和Bax的蛋白表达降低、Bcl-2 蛋白表达升高、细胞的总凋亡率降低（P< 0.05）；与Inhibitor-NC 组比较，Inhibitor 组细胞内miR-27a-3p 的表达下调、Ccaspase-3 和Bax 的蛋白表达升高、细胞的总凋亡率增加（P< 0.05），细胞的活力和Bcl-2 蛋白表达无明显变化（P> 0.05），见表2 和图1、2。

图1 各组凋亡相关蛋白C-caspase-3、Bax 和Bcl-2 表达的Western blot 图Fig.1 Western blot of apoptosis-related proteins C-caspase-3，Bax and Bcl-2 in each group

图2 各组细胞凋亡率的流式细胞术检测图Fig.2 Flow cytometry analysis of apoptosis rate in each group

表2 各组细胞的活力，miR-27a-3p、凋亡相关蛋白的表达和细胞总凋亡率Tab.2 Cell viability，the expression of miR-27a-3p、apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group ±s

表2 各组细胞的活力，miR-27a-3p、凋亡相关蛋白的表达和细胞总凋亡率Tab.2 Cell viability，the expression of miR-27a-3p、apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group ±s

注：与Control组比较，*P < 0.05；与Mimic-NC组比较，△P < 0.05；与Inhibitor-NC组比较，▲P < 0.05

组别Control组OGD/R组Mimic-NC组Mimic组Inhibitor-NC组Inhibitor组F值P值细胞总凋亡率（%）3.55 ± 0.14 11.25 ± 0.09*12.44 ± 0.76 5.28 ± 0.43△11.93 ± 0.55 15.67 ± 0.50▲95.94< 0.001 miR-27a-3p 1.02 ± 0.14 0.27 ± 0.00*0.23 ± 0.01 0.70 ± 0.06△0.23 ± 0.01 0.15 ± 0.01▲30.47< 0.001细胞的活力（%）100.00 ± 1.21 59.01 ± 1.71*60.95 ± 3.08 74.84 ± 2.25△59.95 ± 2.29 53.58 ± 3.04 52.92< 0.001 C-caspase-3 0.42 ± 0.02 1.00 ± 0.04*0.79 ± 0.07 0.49 ± 0.06△0.82 ± 0.05 1.17 ± 0.08▲24.28< 0.001 Bax 0.28 ± 0.04 0.78 ± 0.07*0.89 ± 0.03 0.40 ± 0.06△0.77 ± 0.05 1.14 ± 0.07▲33.10< 0.001 Bcl-2 0.96 ± 0.01 0.41 ± 0.03*0.42 ± 0.02 0.69 ± 0.07△0.37 ± 0.02 0.30 ± 0.08 29.78< 0.001

2.3 miR⁃27a⁃3p靶向调控Rnd3的表达 与Control组比较，OGD/R 组PC12 细胞内Rnd3 mRNA 和蛋白的表达均上调（P< 0.05）；与Mimic-NC 组比较，Mimic 组细胞内Rnd3 mRNA 和蛋白的表达均下调（P< 0.05）；与Inhibitor-NC 组比较，Inhibitor 组细胞内Rnd3 mRNA 和蛋白的表达均上调（P< 0.05），见表3 和图3。TargetScan 数据库预测结果显示miR-27a-3p与Rnd3存在紧密结合位点，见图4。双荧光素酶报告基因结果显示，与Rnd3/Wt和Mimic-NC共转染组比较，Rnd3/Wt 和Mimic 共转染组的荧光素酶相对活性降低（P< 0.01）；与Rnd3/Mut 和Mimic-NC共转染组比较，Rnd3/Mut和Mimic共转染组的荧光素酶相对活性差异无统计学意义（P> 0.05），证实miR-27a-3p 能靶向调控Rnd3 的表达，见表4。

图3 各组细胞内Rnd3 蛋白表达的Western blot 图Fig.3 Western blot of Rnd3 protein in each group

图4 TargetScan 数据库预测的miR-27a-3p 与Rnd3 之间的结合位点Fig.4 Binding sites between miR-27a-3p and Rnd3 predicted by TargetScan database

表3 上调miR-27a-3p 和下调miR-27a-3p 对Rnd3 mRNA和蛋白表达的影响Tab.3 Effects of up-regulation and down-regulation of miR-27a-3p on the expression of Rnd3 mRNA and protein±s

表3 上调miR-27a-3p 和下调miR-27a-3p 对Rnd3 mRNA和蛋白表达的影响Tab.3 Effects of up-regulation and down-regulation of miR-27a-3p on the expression of Rnd3 mRNA and protein±s

注：与Control组比较，*P < 0.05；与Mimic-NC组比较，△P < 0.05；与Inhibitor-NC组比较，▲P < 0.05

Rnd3 蛋白0.14 ± 0.01 0.64 ± 0.05*0.64 ± 0.05 0.45 ± 0.04△0.56 ± 0.05 1.05 ± 0.08▲34.14< 0.001组别Control组OGD/R组Mimic-NC组Mimic组Inhibitor-NC组Inhibitor组F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.08 3.12 ± 0.11*3.72 ± 0.44 1.71 ± 0.14△3.32 ± 0.12 5.81 ± 0.14▲63.35< 0.001

表4 miR-27a-3p 与Rnd3 结合的各组细胞的荧光素酶相对活性Tab.4 Relative luciferase activity of miR-27a-3p combined with Rnd3 in each group±s

表4 miR-27a-3p 与Rnd3 结合的各组细胞的荧光素酶相对活性Tab.4 Relative luciferase activity of miR-27a-3p combined with Rnd3 in each group±s

注：与Rnd3/Wt+Mimic-NC组比较，*P < 0.05

组别Rnd3/Wt+Mimic-NC组Rnd3/Wt+Mimic组Rnd3/Mut+Mimic-NC组Rnd3/Mut+Mimic组F值P值荧光素酶相对活性1.00 ± 0.02 0.73 ± 0.06*1.01 ± 0.04 1.00 ± 0.05 9.303< 0.001

2.4 Rnd3 干扰片段的筛选结果 与shRnd3-NC组比较，shRnd3-002、shRnd3-003 和shRnd3-004 组细胞内Rnd3 mRNA 和蛋白的相对表达量均降低（P< 0.05）；与shRnd3-003 和shRnd3-004 组比较，shRnd3-002 组细胞内Rnd3 mRNA 和蛋白的相对表达量均降低（P< 0.05），因此选择shRnd3-002 干扰片段进行后续下调Rnd3 表达的实验，见表5和图5。

图5 各Rnd3 干扰片段作用下Rnd3 蛋白表达的Western blot 图Fig.5 Western blot of Rnd3 protein expression with the various Rnd3 interference fragments

表5 各Rnd3 干扰片段对Rnd3 mRNA 和蛋白表达的影响Tab.5 Effects of Rnd3 interference fragments on the expression Rnd3 mRNA and protein±s

表5 各Rnd3 干扰片段对Rnd3 mRNA 和蛋白表达的影响Tab.5 Effects of Rnd3 interference fragments on the expression Rnd3 mRNA and protein±s

注：与shRnd3-NC组比较，*P < 0.05；与shRnd3-003组比较，△P <0.05；与shRnd3-004组比较，▲P < 0.05

Rnd3 蛋白0.87 ± 0.12 0.97 ± 0.12 1.08 ± 0.19 0.38 ± 0.03*△▲0.66 ± 0.03*0.63 ± 0.08*5.63< 0.001组别Control组shRnd3-NC组shRnd3-001组shRnd3-002组shRnd3-003组shRnd3-004组F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.11 1.03 ± 0.04 1.28 ± 0.04 0.07 ± 0.02*△▲0.63 ± 0.03*0.47 ± 0.09*47.65< 0.001

2.5 下调Rnd3 对OGD/R 损伤PC12 细胞活力和细胞凋亡的影响以及下调miR⁃27a⁃3p 的逆转作用 与Control 组比较，OGD/R 组Rnd3 mRNA 和蛋白的表达均升高、细胞的活力降低、C-caspase-3 和Bax 的蛋白表达升高、Bcl-2 蛋白表达降低、细胞总凋亡率增加（P< 0.05）；与shRnd3-NC 组相比，shRnd3 组Rnd3 mRNA 和蛋白的表达均降低、细胞的活力增加、C-caspase-3 和Bax 的蛋白表达降低、Bcl-2蛋白表达升高、细胞总凋亡率降低（P< 0.05）；与shRnd3 比较，shRnd3+Inhibitor 组Rnd3 mRNA 和蛋白的表达均升高、细胞的活力降低、C-caspase-3和Bax 的蛋白表达升高、细胞总凋亡率增加（P<0.05），Bcl-2蛋白表达差异无统计学意义（P> 0.05）。下调miR-27a-3p 逆转了下调Rnd3 的作用，进一步证明miR-27a-3p 靶向调控 Rnd3 的表达，见表6、7和图6、7。

图6 各组Rnd3 蛋白和凋亡相关蛋白C-caspase-3、Bax 和Bcl-2 表达的Western blot 图Fig.6 Western blot of Rnd3 protein and apoptosis-related proteins C-caspase-3，Bax and Bcl-2 in each group

图7 各组细胞凋亡率的流式细胞术检测图Fig.7 Flow cytometry analysis of apoptosis rate in each group

表6 各组Rnd3 mRNA 和蛋白的表达量Tab.6 Expression of Rnd3 mRNA and protein in each group±s

表6 各组Rnd3 mRNA 和蛋白的表达量Tab.6 Expression of Rnd3 mRNA and protein in each group±s

注：与Control组比较，*P < 0.05；与shRnd3-NC组比较，△P < 0.05；与shRnd3组比较，▲P < 0.05

Rnd3 蛋白0.11 ± 0.02 0.71 ± 0.05*0.69 ± 0.02 0.22 ± 0.03△0.52 ± 0.07▲41.17< 0.001组别Control组OGD/R组shRnd3-NC组shRnd3组shRnd3+Inhibitor组F值P值Rnd3 mRNA 1.01 ± 0.05 1.52 ± 0.06*1.02 ± 0.06 0.12 ± 0.00△1.02 ± 0.02▲127.40< 0.001

表7 各组细胞的活力、凋亡相关蛋白的表达和细胞总凋亡率Tab.7 Cell viability，the expression of apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group±s

表7 各组细胞的活力、凋亡相关蛋白的表达和细胞总凋亡率Tab.7 Cell viability，the expression of apoptosis-related proteins and total apoptosis rate in each group±s

注：与Control组比较，*P < 0.05；与shRnd3-NC组比较，△P < 0.05；与shRnd3组比较，▲P < 0.05

组别Control组OGD/R组shRnd3-NC组shRnd3组shRnd3+Inhibitor组F值P值细胞总凋亡率（%）3.38 ± 0.16 11.59 ± 0.69*12.10 ± 0.73 4.09 ± 0.35△8.96 ± 0.85▲44.81< 0.001细胞的活力（%）100.00 ± 3.08 62.86 ± 2.05*64.77 ± 3.53 88.12 ± 2.74△68.16 ± 2.13▲35.34< 0.001 C-caspase-3 0.07 ± 0.00 0.64 ± 0.04*0.49 ± 0.03 0.17 ± 0.01△0.62 ± 0.04▲81.70< 0.001 Bax 0.14 ± 0.01 0.92 ± 0.04*0.74 ± 0.03 0.27 ± 0.01△0.98 ± 0.04▲150.8< 0.001 Bcl-2 0.68 ± 0.02 0.36 ± 0.01*0.18 ± 0.01 0.49 ± 0.02△0.46 ± 0.02 124.5< 0.001

3 讨论

CI-RI 常常给患者的神经功能带来不可逆的损害，然而，目前治疗方法有限。MicroRNAs 能在中枢神经系统广泛表达，并参与调节多种神经系统疾病，如缺血性卒中［8］、胶质瘤［9］、阿尔茨海默病［10］等。神经细胞的凋亡是CI-RI 后的常见病理事件，与后期的神经功能缺损密切相关。CI-RI 早期促凋亡蛋白如Cleaved Caspase-3、Bax 等的大量表达都会加重细胞的凋亡［11］。

本研究在CI-RI 的体外模型中观察到PC12 神经细胞在OGD/R 后细胞活力下降，细胞的凋亡增加。同时，OGD/R 后胞内的miR-27a-3p 表达下调，由此推测miR-27a-3p 可能参与了细胞凋亡的过程。miR-27a-3p 是一种具有多种调控功能的miRNA，已有研究［12］表明，miR-27a-3p 参与了多种疾病的细胞凋亡调控过程。在缺血再灌注损伤的心肌细胞中，miR-27a-3p 的上调通过抑制自噬介导了七氟烷的抗凋亡作用。此外，miR-27a-3p 的上调通过靶向抑制LITAF 和TLR4 通路，减轻脑缺血-再灌注损伤大鼠的炎症反应和细胞凋亡［13］。另有研究［14］表明，miR-27a-3p 的上调可减轻LPS诱导的炎症反应，并通过靶向调控OXSR1 表达抑制肾小管上皮HK-2 细胞的凋亡。本研究发现，上调miR-27a-3p 提高了OGD/R 损伤后的细胞活力和抑制了细胞的凋亡，而下调miR-27a-3p 则作用相反，表明在OGD/R 损伤模型中，miR-27a-3p 能抑制细胞凋亡而发挥保护作用。

生物信息学预测结果显示Rnd3 的3'-UTR 区具有miR-27a-3p 的结合位点，双荧光素酶实验证实miR-27a-3p 能够靶向作用于Rnd3，此外，上调miR-27a-3p 能使其表达下调，下调miR-27a-3p 则使其表达上调，进一步证明了miR-27a-3p 能够靶向调控Rnd3 的表达。Rnd3 也被称为RhoE，是一种小GTP 结合蛋白，在中枢神经系统中可大量表达［15］。已有研究［16-17］发现，Rnd3 的上调具有促进细胞凋亡的作用，而Rnd3 基因的缺失则抑制了神经细胞的凋亡。此外，研究［18］证实Rnd3 可通过激活IRAK/ERK/NF-KB 信号通路，加重乙醇诱导的星形胶质细胞的细胞凋亡。本研究结果显示，OGD/R 损伤后细胞凋亡加剧，而胞内Rnd3 的表达明显升高。因此，在OGD/R 损伤的PC12 细胞中，miR-27a-3p 的抗凋亡作用可能与其对Rnd3 的抑制作用有关。

为了进一步证实Rnd3 的作用及其是否参与了miR-27a-3p 的抗凋亡机制，笔者构建了特异性的shRNA 下调PC12 细胞中Rnd3 的表达。结果发现，转染shRnd3 后，胞内Rnd3 的表达降低，同时，细胞的活力提高、细胞凋亡下降，表明下调Rnd3具有抑制神经细胞凋亡的作用。然而，下调miR-27a-3p 则消除了miR-27a-3p 对Rnd3 的抑制效应，在转染shRnd3 的情况下使Rnd3 的表达上调，逆转了shRnd3 产生的抗凋亡作用，导致shRnd3 不能进一步减轻OGD/R 引发的细胞损伤，由此表明，miR-27a-3p 通过抑制Rnd3 的表达减轻了细胞凋亡。

综上所述，上调miR-27a-3p 对OGD/R 损伤的PC12 神经细胞具有保护作用，其作用机制是通过靶向抑制Rnd3 的表达进而抑制细胞凋亡。本研究将为CI-RI 损伤治疗靶点的选择提供理论参考，但也存在一定的局限性，仅仅进行了细胞实验，缺乏相关动物实验的证据，下一步有待进一步通过动物实验来阐明miR-27a-3p 调控Rnd3 对CI-RI的影响。

【Author contributions】LI Junjie performed the experiments and wrote the article.BAI Wenya performed the experiments.CHEN Wen⁃dong and YANG Wei revised the article.SHAO Jianlin designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.