基于网络药理学研究补阳还五汤治疗脊髓损伤的作用机制

钟木森 安忠诚 樊光亚 暴纪谦 苏文硕 董黎强

[摘要] 目的 基于網络药理学、分子对接验证补阳还五汤治疗脊髓损伤的作用机制。方法 通过TCMSP、SymMap、PubChem、Swiss Target Prediction数据库筛选补阳还五汤的活性成分和靶点。从OMIM、GeneCards、TTD、DrugBank数据库检索脊髓损伤的靶点。通过venny软件获取补阳还五汤与脊髓损伤的交集靶点。用Cytoscape软件构建补阳还五汤治疗脊髓损伤的活性成分-靶点网络。通过DAVID数据库对共同靶点进行基因本体论和京都基因与基因组百科全书富集分析，分子对接技术分析药物与靶点的结合能力。结果 共得到补阳还五汤中活性成分106个，作用靶点225个，脊髓损伤靶点1315个，药物-疾病交集靶点112个。补阳还五汤主要通过槲皮素、山柰酚、鞣花酸、木樨草素、常春藤皂苷元等药物活性成分治疗脊髓损伤。结论 补阳还五汤可通过多种信号通路达到治疗脊髓损伤的目的。

[关键词] 补阳还五汤；脊髓损伤；网络药理学；作用机制；分子对接

[中图分类号] R683.2      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.01.016

Mechanism of Buyang Huanwu decoction in the treatment of spinal cord injury based on network pharmacology

ZHONG Musen1， AN Zhongcheng2， FAN Guangya1， BAO Jiqian1， SU Wenshuo1， DONG Liqiang2

1.The Second School of Clinical Medicine， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， Zhejiang， China;         2.Department of Orthopedics， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To verify the mechanism of Buyang Huanwu decoction in the treatment of spinal cord injury based on network pharmacology and molecular docking. Methods The active ingredients and targets of Buyang Huanwu decoction were screened out by TCMSP， SymMap， PubChem and Swiss Target Prediction databases. Spinal cord injury targets were retrieved from OMIM， GeneCards， TTD， and DrugBank databases. Through venny software， the intersection target of Buyang Huanwu decoction and spinal cord injury was obtained. The active ingredient-target network for the treatment of spinal cord injury was constructed with Cytoscape software. Gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis of common targets were carried out by DAVID， and the binding ability of drugs and targets was analyzed by molecular docking technology. Results A total of 106 active ingredients and 225 targets of Buyang Huanwu decoction， 1315 targets of spinal cord injury and 112 targets of drug-disease intersection were obtained. The active ingredients of Buyang Huanwu decoction were quercetin， kaempferol， ellagic acid， luteolin and hederagenin in the treatment of spinal cord injury. Conclusion Buyang Huanwu decoction can achieve the purpose of treating spinal cord injury through various signal pathways.

[Key words] Buyang Huanwu decoction; Spinal cord injury; Network pharmacology; Mechanism of action; Molecular docking

脊髓损伤是一种致残率高、治疗时间长且费用高昂的中枢神经系统疾病[1-2]。我国脊髓损伤的年患病率为37人次/100万，男性高于女性，主要由坠落伤、交通事故等因素引起[3]。现代医学主要采取多学科协作的诊疗方案，主要包括急性期的外科治疗和亚急性期及后期的康复治疗，但治疗效果有限[4]。传统中医学没有脊髓损伤的病名，但历代典籍将该病归为痿证、体惰。《灵枢·寒热病》指出“身有所伤，血出多……四肢懈惰不收，名曰体惰”。中医学主要以补法、通法作为治疗脊髓损伤的治法。清代王清任所著《医林改错》中的补阳还五汤是治疗气虚血滞、脉络瘀阻导致半身不遂、口眼㖞斜、语言謇涩的经典方，具有益气、活血、通络之功。动物实验表明，补阳还五汤可通过改善缺血状态、抗炎、抗氧化、减少神经细胞凋亡等方式治疗脊髓损伤[5]。本文通过网络药理学和分子对接技术研究补阳还五汤治疗脊髓损伤的主要药物成分及相关信号通路，旨在为临床治疗提供诊疗思路。

1  材料与方法

1.1  药物活性成分筛选及靶点预测

检索中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmsp- e.com/tcmsp.php）查找补阳还五汤中黄芪、桃仁、红花、赤芍、川芎、当归成分及作用靶点，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18筛选补阳还五汤的有效成分及药效靶点[6]。因TCMSP中未找到地龙，故在SymMap数据库（www.symmap.org）搜索地龙的有效成分，在PubChem数据库（https：//pubchem. ncbi.nlm.nih.gov）下载地龙有效成分的SDF文件，筛选GIabsorption为“HIGH”、DL评估中≥3个“YES”，通过Swiss Target Prediction数据库（http：//swisstargetprediction.ch）预测其作用靶点。利用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org）转换靶点的基因名称。

1.2  疾病靶点基因筛选

以“spinal cord injury”为关键词，通过OMIM数据库（https：//www.omim.org）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）、TTD数据库（https：//db.idrblab.net/ttd）、DrugBank数据库（https：//go.drugbank.com）筛选相关系数≥8的靶点，随后整合，去除重复值，得到脊髓损伤的靶点并导出检索结果。

1.3  中药成分-疾病靶点网络构建

通过venny2.1.0绘制成分靶点与疾病靶点的韦恩图，取二者交集靶点，并将其数据输入Cytoscape 3.7.2软件，构建中药成分-靶点网络。

1.4  蛋白-蛋白相互作用网络的构建

将交集靶点输入STRING（https：//cn.string-db.org），筛选“Homo sapiens”，置信度≥0.400，去除重复后导出。利用Cytoscape 3.7.2软件进行数据可视化分析。

1.5  信号通路分析

把药物、疾病的交集靶点输入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov）进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析，设置筛选条件为P<0.05，在微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）平台通过生物过程、分子功能、细胞组分和KEGG信号通路选择P值最小的前20条结果制作条形图和气泡图。

1.6  活性成分-核心靶点的分子对接

在PDB数据库（https：//www.rcsb.org）、PubChem数据库中获取关键蛋白和关键化合物的3D结构，使用PyMol软件对所有关键蛋白进行加氢处理，利用ADFRsuite 1.0将关键化合物及关键蛋白转换为PDBQT格式，用AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接。

2  结果

2.1  补阳还五汤活性成分靶点收集

补阳还五汤中满足条件的化合物共106个，其中包括黄芪20个成分、桃仁23个成分、红花22个成分、赤芍29个成分、川芎7个成分、当归2个成分、地龙3个成分。收集靶点基因共546个，除去重復靶点321个，剩余225个靶点基因。

2.2  脊髓损伤作用靶点筛选

检索GeneCards数据库得到1218个靶点，检索OMIM数据库得到107个靶点，检索DrugBank数据库得到15个靶点，检索TTD数据库得到7个靶点，整合去重后获得1315个靶点。

2.3  补阳还五汤活性成分-靶点-疾病网络构建

通过venny2.1.0平台绘制药物成分和疾病靶点的韦恩图，取得共同靶点112个，见图1。通过Cytoscape 3.7.2软件构建活性成分-疾病靶点网络图，根据Cytoscape软件算出有效成分的degree值，degree值越大，表示节点越重要。结果显示degree值前5位的分别为槲皮素、山柰酚、鞣花酸、木樨草素、常春藤皂苷元，见表1。

2.4  蛋白-蛋白相互作用网络结果

将共同靶点信息导入STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络。筛选出前6位关键靶点为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、肿瘤蛋白P53（tumor protein P53，TP53）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、IL-1β。

2.5  GO和KEGG通路富集分析

GO富集分析得到932个结果，其中与生物过程有关的727个，包括基因表达的正向调控、细胞凋亡的正负向调控、药物反应、对脂多糖的反应等，见图2；与细胞组分有关的83个，涉及细胞外间隙、膜筏、细胞表面、线粒体等，见图3；与分子功能有关的122个，涉及酶结合、蛋白质结合、转录因子结合等，见图4。根据P值排序，取前20个富集结果制作成条状图。KEGG分析得到446条重要信号通路，主要涉及晚期糖基化终末产物（advanced glycation end product，AGE）/晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end product，RAGE）信號通路、IL-17信号通路、VEGF信号通路、TNF信号通路、磷脂酰肌醇3激酶

（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号通路等。根据P值，取前20条信号通路绘制气泡图，见图5。

2.6  分子对接分析

以degree值较高的成分槲皮素、山奈酚、鞣花酸、木犀草素、常春藤皂苷元与关键靶点TNF、IL-6、AKT1、TP53、VEGFA、IL-1β进行分子对接，结果显示5个主要活性成分与6个关键靶点均具有良好的结合能力，结合能均≤–5.0kcal/mol，见表2。对接结果可视化见图6。

3  讨论

脊髓损伤常伴随着诸多并发症，包括损伤平面以下的肢体瘫痪、神经病理性疼痛、功能障碍等，给患者造成极大的精神折磨和经济负担。目前仍无法完全治愈脊髓损伤，只能尽量减少神经、组织、细胞的继发性损伤，尽可能恢复脊髓残余功能[7]。中医认为，脊髓损伤多由坠落跌扑等外因和筋脉失养等内因造成，多属气滞血瘀证。治疗上以益气活血通络为主，补阳还五汤是益气活血法中的代表方，研究表明补阳还五汤对脊髓损伤有较好疗效[8]。

补阳还五汤中生黄芪大补元气，以促血行，祛瘀通络，为君药。当归尾活血通络而不伤血，为臣药。赤芍、川芎、桃仁、红花助当归尾活血祛瘀，为佐药；地龙通经活络，引导药力直达络中，为佐使药。诸药合用共奏益气、消瘀、通络之功。本研究发现，补阳还五汤中有106个化合物，其中槲皮素、山奈酚、鞣花酸、木犀草素、常春藤皂苷元可能是治疗脊髓损伤的有效成分。

槲皮素存在于黄芪、红花中，是一种具有抗炎、抗癌、抗感染和抗氧化的黄酮醇，它可通过激活PI3K/AKT信号通路抑制神经细胞凋亡下游相关分子的表达，如胱天蛋白酶-3（caspase-3）、caspase-6、caspase-9、Bcl-2与Bax，降低IL-4、IL-6、TNF-α等炎症因子水平；还可通过信号转导及转录活化因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路抑制巨噬细胞/小胶质细胞极化为M1型，同时促进极化为M2型巨噬细胞[9-10]。Firgany等[11]提出槲皮素可通过降低谷氨酸兴奋性毒性使磷酸化活化转录因子2基因表达降低，抑制p38丝裂原激活的蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）信号通路。此外槲皮素还可间接通过激活星形胶质细胞摄取和处理细胞外的谷氨酸，减少谷氨酸兴奋性毒性，从而降低Ca2+浓度、清除自由基、抑制脂质过氧化。槲皮素多以苷的形式存在，如槲皮素-3-O-葡萄糖苷，该化合物可激活AKT磷酸化、细胞周期蛋白D1表达和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的产生，发挥神经保护作用。

山柰酚存在于黄芪、红花中，是一种常见的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化的药理作用。它能通过抑制DNA和髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）的NF-κB结合活性、抑制IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α的释放、增加核转录因子红系2相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）调控基因的mRNA和蛋白表达、抑制Toll样受体4等不同作用机制发挥抗炎作用[12-15]。研究显示，山奈酚是一种很好的抗氧化剂，它可抑制小胶质细胞活化来缓解氧化应激，降低还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4介导的活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生[16]。其中，线粒体碎裂诱导的ROS可导致神经元损伤并激活MAPK、NF-κB引发神经炎症，山奈酚或许可减轻线粒体损伤。

鞣花酸存在于赤芍中，是一种天然多酚组分，具有较强的抗氧化、抗炎作用。它可通过清除自由基、增强抗氧化酶的活性、抑制脂质过氧化和减少ROS产生等多种方式发挥抗氧化作用[17]。鞣花酸还可抑制包括NF-κB、MAPK和JAK-STAT等多条炎症信号通路。鞣花酸与NF-κB前体蛋白p105结合，阻碍NF-κB与特定DNA结构域结合，抑制NF-κB调控基因表达[18]。鞣花酸还能抑制NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）的磷酸化及影响NF-κB易位从而抑制NF-κB信号通路[19]。MAPK是细胞内一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。有研究证实鞣花酸可以剂量依赖性方式抑制MAPK信号通路的激活，降低相关促炎因子的基因表达[20]。鞣花酸还可抑制JAK1、JAK2和STAT1的磷酸化，阻断JAK-STAT信号通路的反应途径[21]。

木犀草素存在于红花中，是一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化等作用。它通过激活PI3K/AKT通路清除细胞外的ROS减少氧化应激、调节Bcl-2/Bax比例、抑制过氧化氢等方式来调节细胞凋亡[22]。研究发现，木犀草素可通过低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）信号通路抑制HIF-1α、NLRP3和caspase-1蛋白表达，还具有升高超氧化物歧化酶活性、降低丙二醛含量及促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）表达的作用，缓解细胞凋亡及炎症反应[23]。研究发现木犀草素可促进Nrf2从细胞质到细胞核的易位，通过激活Nrf2-ARE信号通路减少氧化应激[24]。木犀草素可抑制髓鞘碱性蛋白诱导肥大细胞的活化来发挥抗氧化作用，还可抑制小胶质细胞活化及调控BDNF的表达、降低包括BIM、P53、TRB3等上调基因的mRNA表达，从而减少神经细胞的凋亡[25]。

常春藤皂苷元存在于黄芪、桃仁中，具有抗炎、抗氧化、抗神经退行性的药理作用，可通过抑制p38MAPK磷酸化来减轻氧化应激对MAPK通路的激活作用、降低诱导型一氧化氮合酶、环氧合酶2表达水平，减少TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子，清除自由基和抑制一氧化氮产生[26-27]。研究表明常春藤皂苷可通过恢复线粒体电位的改变，减少ROS积累以保护神经细胞；还可通过浓度依赖的方式促进PI3K/AKT信号通路下游靶标磷酸化及上调BDNF来调节细胞凋亡[28]。研究发现，常春藤皂苷元可通过降低IκBβ、IκBα、p65磷酸化水平抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用[29]。

综上所述，补阳还五汤治疗脊髓损伤的作用机制涉及多成分、多靶点参与的多种生物过程和信号通路。方中的黄芪、桃仁、红花、赤芍、当归、川芎等关键成分可通过多种信号通路发挥抗氧化应激、抗炎、抗神经元凋亡等作用，治疗脊髓损伤。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

[参考文献]

• RÍOS J L， GINER R M， MARÍN M， et al. A pharmacological update of ellagic acid[J]. Planta Med， 2018， 84（15）： 1068–1093. 

（收稿日期：2023–03–23）

（修回日期：2023–11–24）