高效液相色谱法测定卤牛肉中苯甲酸含量的不确定度评估

王珊珊 赵雯玮 王文巧

基金项目：西藏自治区科技厅计划项目（XZ202001ZY0058G）；西藏自治区食品药品检验研究院科研项目（XZSYJY-YJKYXM-2020-02）。

作者简介：王珊珊（1990—），女，河南安阳人，硕士，助理工程师。研究方向：食品营养、食品理化检测。

通信作者：赵雯玮（1978—），女，河南安阳人，硕士，高级工程师。研究方向：食品安全检验与食品营养成分分析。E-mail：24491675@qq.com。

摘 要：本实验采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定卤牛肉中苯甲酸的含量，并进行不确定度评估，结合数学模型与实验全过程，确认苯甲酸标准系列溶液配制、样品处理、标准曲线拟合、仪器测定4个过程为不确定度的主要来源，通过分析、计算，得到苯甲酸的含量为

0.215 4 g·kg-1，其扩展不确定度为0.018 5 g·kg-1，苯甲酸含量可以表示为（0.215 4±0.018 5）g·kg-1（k=2，置信区间95%）。此外，对上述4个过程的不确定度进行比较，发现标准曲线拟合过程引入的不确定度是总不确定度的主要来源，系列标准曲线配制过程和仪器测定对不确定度的影响相当，样品制备过程的影响较小。本实验为此类食品苯甲酸含量测定的不确定度评估提供依据。

关键词：高效液相色谱法；卤牛肉；苯甲酸；不确定度

Evaluation of Uncertainty in Determination of Benzoic Acid in Braised Beef by HPLC

WANG Shanshan， ZHAO Wenwei*， WANG Wenqiao

（Tibet Autonomous Region Food and Drug Inspection Research Institute， Lhasa 850000， China）

Abstract： This experiment used high performance liquid chromatography （HPLC） to determine the content of benzoic acid in braised beef， and evaluated the uncertainty. Combining mathematical models and the entire experimental process， it was confirmed that the preparation of benzoic acid standard series solution， sample processing， standard curve fitting， and instrument measurement were the main sources of uncertainty. Through analysis and calculation， the content of benzoic acid was 0.215 4 g·kg-1， Its expanded uncertainty is 0.018 5 g·kg-1，

and the benzoic acid content can be expressed as （0.215 4±0.018 5） g·kg-1 （k=2， confidence interval 95%）. In addition， comparing the uncertainty of the four processes mentioned above， it was found that the uncertainty introduced by the standard curve fitting process is the main source of total uncertainty. The influence of the series standard curve preparation process and the instrument measurement process  on uncertainty is similar， while the influence of the sample preparation process is relatively small. This experiment provides a basis for evaluating the uncertainty of the determination of benzoic acid content in such foods.

Keywords： high performance liquid chromatography; spiced beef; benzoic acid; uncertainty

苯甲酸作為最常见的防腐剂，能够抑制霉菌、酵母和细菌，起到延长食品保质期的作用。然而，部分商家在肉类卤制过程中会过量添加此类食品添加剂，对人体造成不良影响。研究表明，过量食用苯甲酸会影响摄入者肠胃消化酶的正常分泌[1-2]，降低小肠的吸收能力，使食欲减退，另外食用苯甲酸有致癌和遗传伤害可能性[3]。

测量不确定度是根据检验信息，表征赋予被测量值分散性的非负参数[4]，本文对HPLC法测定卤牛肉中苯甲酸含量的方法进行系统分析，识别测定过程中的不确定来源，建立数学模型，计算测定结果的合成标准不确定度和相对标准不确定度，为同类项目测定结果的不确定度评价和分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

卤牛肉，市场随机购买的阳性样本。

苯甲酸标准物质储备液：GBW（E）100006 22001，中国计量科学研究院；亚铁氰化钾：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；乙酸锌：分析纯，成都市科隆化学品有限公司；乙酸铵：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇：色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司。

Agilen-1260 液相色谱仪，美国安捷伦公司；XP203S电子分析天平，瑞士梅特勒公司；P300H超声波清洗仪，德国Elma；ST1L台式高速离心机，英国赛默世尔；DMT-2500多管涡旋混合仪，中国江苏盛蓝。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

按照《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）[5]第一法液相色谱法规定过程，处理样品。

样品加标：取2 g（精确到0.001 g）样品于离心管中，加入浓度为1 mg·mL-1的苯甲酸储备溶液

0.4 mL，苯甲酸加标量为0.4 mg，同样品处理方法处理后，过膜待上机测定。

1.2.2 苯甲酸系列标准溶液的配制

40 μg·mL-1苯甲酸中间液的配制：吸取

1.00 mg·mL-1苯甲酸储备液1.00 mL于25 mL容量瓶中，用水定容。

苯甲酸系列标准溶液的配制：分别准确吸取

40 μg·mL-1苯甲酸中间液0.125 mL、0.500 mL、

1.000 mL、2.000 mL、3.000 mL、4.000 mL和

5.000 mL于10 mL容量瓶中，用水定容。配制成质量浓度为0.500 μg·mL-1、2.000 μg·mL-1、4.000 μg·mL-1、8.000 μg·mL-1、12.000 μg·mL-1、16.000 μg·mL-1和20.000 μg·mL-1的标准系列工作溶液。

1.2.3 液相色谱条件

流动相：甲醇∶乙酸铵（0.02 mol·L-1）=5∶95（V∶V）等度洗脱；色谱柱：Eclipse Plus C18

（250 mm×4.6 mm，5 μm）；进样量10 μL；流速：

1.00 mL·min-1；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃。

2 不确定度评定

2.1 建立数学模型

苯甲酸含量计算公式为

（1）

式中：X为试样中苯甲酸的含量，g·kg-1；C为标准曲线得出的试样中苯甲酸的含量，μg·mL-1；

V为试样定容体积，mL；m为试样质量；g；1 000为换算因子。

2.2 不确定度主要来源分析

從样品处理测定总流程和数学模型考虑，卤牛肉中苯甲酸的不确定度主要来源如图1所示。

2.3 不确定度的计算

2.3.1 苯甲酸系列标准溶液配制过程引入的相对标准不确定度urel（S）

（1）苯甲酸标准物质引入的相对标准不确定度。证书显示：苯甲酸溶液标准物质标准值1.00 mg·mL-1；相对扩展不确定度为2%（k=2），则使用苯甲酸标准溶液引入的相对标准不确定度为urel（C）=2%÷2=0.01。

（2）40.00 ?g·mL-1苯甲酸中间液的配制引入的相对标准不确定度。苯甲酸中间液的配制使用了

1.00 mL移液管和25 mL容量瓶，因使用量器引入的不确定度计算过程相同，本文以1.00 mL移液管的不确定度计算为例，其他量器的不确定度计算不再赘述，并将结果汇总如表1。

1.00 mL移液管引入的不确定度计算：经查阅移液管校准证书，其准确度等级均为A级，容量允许差为±0.01 mL[6]，按照均匀分布，取，使用1.00 mL移液管引入的标准不确定度为。

设移取液体时的温度与校准要求温度的差异为±5 ℃，水的膨胀系数为2.1×10-4 ℃-1，因温度差异引入的体积变化为±（1.00×5×2.1×10-4）=±0.001 05 mL，

按均匀分布，，吸取液体时温度差异引入的标准不确定度为。

综上，使用一次1.00 mL移液管引入的标准不确定度为

使用一次1.00 mL移液管引入的相对标准不确定度为。

由表1可知使用一次25 mL容量瓶引入的标准不确定度和相对标准不确定度分别为u（V25）=

0.023 0 mL、urel（V25）=0.000 92。

苯甲酸中间液配制过程引入的相对标准不确定度为

苯甲酸系列浓度标准溶液配制过程中引入的不确定度。苯甲酸系列浓度标准溶液配制过程分别用到了1.00 mL移液管3次、5.00 mL移液管4次和

10 mL容量瓶7次。该过程引入的标准不确

定度为

苯甲酸标准物质配制过程引入的相对标准不确定度为

2.3.2 苯甲酸标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel（X）

苯甲酸标准系列浓度溶液经安捷伦高效液相色谱仪收集并积分，得到各浓度点x与其相对应的峰面积y，浓度和峰面积拟合的线性回归方程为y=ax+b（a为斜率，b为截距），测定结果如表2所示。

根据贝塞尔公式[7]，得到苯甲酸标准曲线的剩余标准偏差为

（2）

本次实验对两套标准溶液进行了测定，苯甲酸标准溶液平均浓度为C标=8.93 μg·mL-1。苯甲酸标准曲线的不确定度为

（3）

式（2）和式（3）中：a=21.965，b=-6.269 2，p=14（对标品进行14次测量）；n=14（7个浓度的标准样品分别测定2次）。。则

苯甲酸标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为。

2.3.3 样品处理过程引入的相对标准不确定度urel（M）

（1）称量过程引入的不确定度。经查阅检定证书，样品的称量质量为2.0 g，在0.01 g≤m≤50.00 g范围内时，天平最大允许误差为±0.000 5 g，天平引入的不确定度呈均匀分布，天平的标准不确定度和相对标准不确定度计算为

（2）样品定容过程引入的不确定度。在样品处理过程中用到了50 mL容量瓶，根据表1可知其标准不确定度和相对标准不确定度分别为u（V50）=

0.041 9 mL、urel（V50）=0.000 838。

（3）样品处理过程引入的不确定度。在处理的过程中，添加亚铁氰化钾和乙酸锌除蛋白以及定容转移过程使得样品中苯甲酸不能全部收至待测液中，苯甲酸的回收率在91.31%～99.71%（表3），回收率的标准偏差为2.452%，处理过程引入的标准不确定度与相对标准不确定度

分别为

（4）样品处理全过程中引入的合成相对标准不确定度为

2.3.4 仪器测定过程引入的相对标准不确定度urel（Ap）

高效液相色谱仪自身的不确定度和峰面积的重复性测定引入的不确定度构成了仪器测定引入的标准不确定度。

（1）高效液相色谱仪自身的不确定度。查阅仪器的检定证书，其不确定度为3%，k=2，故仪器自身引入的相对标准不确定度为

（2）重复测定引入的相对标准不确定度。各样品的峰面积结果见表2，重复测定（n=10）引入的标准不确定度和相对标准不确定度分别为

（3）仪器测定引入的相对标准不确定度为

2.3.5 合成标准不确定度u（H）与扩展不确定度U

高效液相色谱法测定卤牛肉中苯甲酸含量的合成相对标準不确定度计算为

本次实验测得卤牛肉中苯甲酸的平均含量

X=0.215 4g·kg-1，其合成标准不确定度为

u（H）=X×urel（H）=0.215 4×0.043 0=0.009 262 g·kg-1

当置信区间为95%时，包含因子为k=2，得到扩展不确定度U=k×u（H）=2×0.009 262=0.018 5 g·kg-1

高效液相色谱法测定卤牛肉中苯甲酸的含量结果表示为X=（0.215 4±0.018 5）g·kg-1（k=2，置信区间95%）。

3 结论

本次实验表明多次称量并测定可以有效避免取样不均的问题，样品的处理过程对总不确定度的影响较小。主要不确定度来源为标准曲线的拟合，标准苯甲酸系列溶液的配制和仪器的测定对总不确定度的影响相当。在今后的实验中，选择纯度更高、不确定度更小的苯甲酸标准物质，规范系列标准溶液的配制操作，选择精密度较高、稳定性较好的测量仪器可以有效提高测定结果的准确度。

参考文献

[1]周楠，丁红梅，杨俊.高效液相色谱法测定蓝莓酵素酒中山梨酸和糖精钠含量的不确定度评定[J].粮食科技与经济，2020，45（8）：95-99.

[2]官咏仪，邱志超，宋阳，等.高效液相色谱法测定葡萄酒中山梨酸含量的不确定度评定[J].食品科学，2015，36（16）：231-235.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.化学分析测量不确定度评定：JJF 1135—2005[S].北京：中国计量出版社，2005.

[5]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和苯甲酸的测定：GB 5009.28—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[6]国家质量监督检验检疫总局.常用玻璃量器检定规程：JJG 196—2006[S].北京：中国计量出版社，2006.

[7]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.测量不确定度评定和表示：

GB/T 27418—2017[S].北京：中国标准出版社，2017.