液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中青霉素类药物残留量的不确定度评定

李歆 汤小苇 张于

作者简介：李歆（1977—），女，江苏宿迁人，本科，高级工程师。研究方向：食品及农产品中农残和兽残的检验和研究。

摘 要：目的：通过高效液相色谱法-串联质谱法的应用合理评定检测鱼肉中青霉素类药物残留量的不确定度。方法：参考《食品安全国家标准 水产品中青霉素类药物多残留的测定 液相色谱－串联质谱法》（GB 31656.12—2021）、《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL 006：2019）中的规定与要求，分析青霉素类药物在测定过程中的各种不确定度来源。结果：当11种青霉素类药物残留量测定结果在21.07～109.86 mg·kg-1时，其扩展不确定度4.64～20.26 mg·kg-1（k=2）。结论：影响不确定度的关键性因素主要有标准溶液的配制过程、标准溶液线性拟合和定容样液的过程。

关键词：液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）；鱼肉；青霉素类药物；不确定度

Uncertainty Evaluation of Determination of Penicillin Residues in Fish by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LI Xin， TANG Xiaowei， ZHANG Yu

（Huaian Product Quality Supervision and Inspection Center， Huaian 223001， China）

Abstract： Objective： To Evaluation of uncertainty in the determination of penicillin residues in fish by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method： According to the provisions and requirements in GB 31656.12—2021， CNAS—GL006：2019， the sources of uncertainty in the determination of penicillins were analyzed. Result： When the results of 11 kinds of penicillin residues were 21.07～109.86 mg·kg-1 the expanded uncertainty is 4.64～20.26 mg·kg-1 （k=2）. Conclusion： The main factors affecting the uncertainty are the preparation process of standard solution， linear fitting of standard solution and the process of constant volume sample solution

Keywords： liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）; fish; penicillinmulti-residues; uncertainty

青霉素作为一类抗菌药品，由青霉菌经过提炼产生，该类抗生素在日常生活中得到了广泛应用，也被称为β-内酰胺类抗生素（β-lactams），主要用于治疗由病原体微生物引起的人畜共患病，在抗生素中占有重要地位。由于其性价比高，常被企业用于畜禽业及水产养殖中的细菌感染防治，但随着用量的增多，越来越多的兽药在动物性食品内残留，造成了十分严重的社会危害[1-2]。在2021—2023年，国家农业部门对相关领域的违法行为采取专项整治措施，提高对该类违法行为的打击力。2019年9月6日，国家正式出台了《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）[3]，于2020年4月1日开始正式实施，对农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》[4]的一些内容进行替代，这也是国家相对较为完善的一部强制性规范，对兽药残留限量问题进行了明确规定，其中针对青霉素类药物的最大残留量、适用靶组织均有明确的规定。

综合研究现状来看，检测青霉素药物的方法主要包括微生物法[5]、酶联免疫法[6-7]、气相色谱法[8]、气相色谱-串联质谱法[9]、液相色谱法[10]、液相色谱-串联质谱法[11-17]。在青霉素药物中由于存在β-内酰胺环，具有不稳定性，对于许多因素均比较敏感，如环境pH值、外界温度以及内部β-内酰胺酶，检测的难度大大提高，為了得到较好的重现性和精密度，往往需要采用高分辨率的检测仪器，液相色谱－串联质谱法的应用最为广泛。在本次研究中，对水产品中的青霉素药物残留按照《食品安全国家标准 水产品中青霉素类药物多残留的测定 液相色谱－串联质谱法》（GB 31656.12—2021）[17]进行测定，参照《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS-GL 006：2019）[18]分析鱼肉中青霉素类药物残留量的不确定度，以期为实验研究提供更多可行的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鱼肉：自购。

阿莫西林、氨苄西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、哌拉西林、阿洛西林和甲氧西林标准物质，100 mg，坛墨质检标准物质中心；乙腈（色谱纯），德国默克公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290/6470型液相色谱-串联质谱仪，美国安捷伦公司；112900台式超速冷冻离心机，美国赛默飞世尔公司；Milli-Q超纯水仪，美国密理博（Millipore）公司；SQP电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 实验方法

样品制备：至少取3尾鱼清洗后，去头、骨、内脏，取肌肉、鱼皮等可食部分绞碎混合均匀后备用；样品量为400 g，分为两份，其中一份用于检验，另一份作为留样[19]。

提取：称取制备好的鱼肉样品2.5 g（±0.02 g），添加1.0 μg·mL-1内标工作液100 μL，静置10 min，添加5 mL的80%乙腈水溶液，涡旋混合1 min，超声10 min，4 ℃，10 000 r·min-1离心5 min，将上清液取出，再将4 mL 80%的乙腈水溶液加入残渣中，重复一次操作，与上清液合并，将其稀释到

10.0 mL，留以备用。

净化：取出大约1 mL的80%乙腈水溶液，润洗固相萃取柱，弃去流出液，取备用液体2.0 mL过柱，保持流速1滴/s，收集，35 ℃氮吹至少0.5 mL，加水定容至0.5 mL，用超滤管以12 000 r·min-1离心

10 min，取濾液，供液相色谱-串联质谱测定。

1.4 仪器条件

色谱柱：Waters C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；温度：35 ℃；流动相：0.05%甲酸水溶液（A）-0.05%甲酸乙腈溶液（B）；流速：

0.4 mL·min-1；进样量：10 μL。梯度洗脱条件见表1。

电喷雾离子源；鞘气流量：11 L·min-1；正离子，MRM模式。具体详见表2。

2 结果与分析

2.1 不确定度数学模型的建立及来源

测量不确定度数学模型为

（1）

式中：X为样品中该类药物的残留量，μg·kg-1；c为由标准工作曲线获得样品进样液中获取的该类药物浓度，ng·mL-1；V为样品定容体积，mL；m为样品质量，g；Rec为回收率，%。

样品中青霉素类药物残留量不确定度主要包括样品称量引入的不确定度、定容样液引入的不确定度、配制标准溶液引入的不确定度、内标物添加体积引入的不确定度、标准溶液线性拟合引入的不确定度、重复性测量引入的不确定度、加标回收率引入的不确定度及液相色谱-串联质谱仪引入的不确定度。在标准系列溶液和样品待测液中内标物含量一致时，内标物的纯度、储备液和工作液的配制等均不影响样品中的目标物含量，故本文仅评估内标物加入的体积引入的不确定度[20]。

2.2 不确定度分量的评定

2.2.1 样品称量引入的相对标准不确定度urel（m）

称量天平为SQP电子天平（仪器的精密度为

0.01 mg），按照相应的检定证书要求可以得出，如果称样量在0～5 g的情况下，允许误差的最大值为±0.05 mg，采取矩形分布的形式，称样量在2.5 g的条件下，所产生的相对标准不确定度为

2.2.2 定容样液引入的相对标准不确定度urel（V）

根据《专用玻璃量器检定规程》

（JJG 10—2005）[21]，容量为5 mL的尖底试管的允许误差是±0.05 mL，分布均匀，其引入的标准不确定度为；实验室的室温控制在（20±5）℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，分布均匀，温度改变引入的标准不确定度为；

则定容样液引入的合成标准不确定度为，相对标准不确定度为。

2.2.3 配制标准溶液引入的相对标准不确定度urel（std）

（1）标准储备液配制引入的相对标准不确定度。①标准物质纯度引入的相对标准不确定度。购买的标准物质纯度及其引入的相对标准不确定度见表3。②标准物质称量引入的相对标准不确定度。标准物质称量使用的天平和样品称量的天平一致，称取依照纯度折算后相当于10 mg，见表4。③标准物质配制过程引入的相对标准不确定度。使用浓度30%乙腈水将其溶解，定容到100 mL容量瓶中，配制浓度0.10 mg·mL-1储备液。100 mL A级容量瓶的误差为±0.10 mL[22]，k=（三角分布），标准不确定度为；实验室的室温需要控制在（20±5）℃，水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，乙腈的体积膨胀系数为1.37×10-3/℃，分布均匀，则温度改变所引入的标准不确定度为。

标准物质配制过程引入的合成标准不确定度，相对标准不确定度为。

标准储备液配制所引入的相对标准不确定度为，通过计算可知，甲氧西林、阿莫西林、氨苄西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、萘夫西林、哌拉西林和阿洛西林标准储备液配制引入的相对标准不确定度urel（V1）分别为0.020 9、0.003 84、

0.004 96、0.003 84、0.010 5、0.003 84、0.003 94、

0.010 4、0.005 16、0.003 83和0.003 84。

（2）标准中间液配制引入的相对标准不确定度。使用1 mL A级单标线吸量管吸取1 mL 0.10 mg·mL-1的标准液，定容到100 mL容量瓶中，配制浓度

0.10 mg·mL-1中间液。1 mL A级单标线量管和100 mL容量瓶在试验中均使用1次。1 mL A级单标线吸量管允许的最大误差达到±0.007 mL[22]，分布均匀，引入的不确定度为；100 mL A级容量瓶的标准不确定度同③是0.040 8 mL；实验室温度改变引入的标准不确定度同2.2.2是0.000 606 mL。

标准中间液配制引入的合成标准不确定度为

则其引入的相对标准不确定度为

（3）标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度。配制标准工作溶液过程引入的不确定度的主要来源于移液器和容量瓶。移液器的容量允差具体见表5（均匀分布）[23]；10 mL A级容量瓶的允许误差在±0.020 mL[23]，三角分布，不确定度为 mL；实验室温度改变引入的标准不确定度同2.2.2是0.000 606 mL。标准工作溶液配制过程中10 mL A级容量瓶引入的合成标准不确定度 mL，相对标准不确定度为。10 mL A级容量瓶在试验过程中应用了7次。

標准工作溶液配制引入的相对标准不确定度为

配制标准溶液引入的相对标准不确定度为。见表6。

2.2.4 内标物添加体积引入的相对标准不确定度urel（IS）

内标工作液（1.0 μg·mL-1）使用移液器（规格100 μL）加入体积为100 μL，容量允许的误差是±2.0%[23]，。

2.2.5 标准溶液线性拟合引入的相对标准不确定度urel（Line）

本实验采用7个标准溶液溶液浓度，线性拟合，获得的回归方程（Y为峰面积，X为浓度），见表7。按照公式（2）算出标准工作溶液线性拟合的标准不确定度u（Line）。

（2）

式中：S（A）为残差的标准差，；c0为检测液的平均浓度，μg·L-1；c为标准溶液的平均浓度，μg·L-1；P为对c0的测量次数，3；N为标准工作溶液的测量次数，21；a为标准曲线的斜率；b为标准曲线的截距。

标准工作溶液线性拟合的相对标准不确定度为。

本次以阿莫西林为例，标准溶液浓度为

1.971 μg·L-1、4.390 μg·L-1、9.000 μg·L-1、21.778 μg·L-1、43.748 μg·L-1、145.551 μg·L-1和301.366 μg·L-1，相对应的峰面积为424、935、1 911、4 616、9 265、

31 541和63 788，其回归方程为Y=213.6X-470.8，相关系数0.999 6，样品平均含量15.249 μg·L-1，则

标准不确定度为

相对标准不确定度为

同理，其他化合物标准溶液线性拟合引入的相对标准不确定度如表7所示。

2.2.6 重复性测量引入的相对标准不确定度urel（Rep）

按照标准方法对样品进行重复性测定。标准偏差为，其标准不确定度为，重复性测定的相对标准不确定度为。

以阿莫西林为例，实际得出的样品浓度为15.249 μg·L-1、16.026 μg·L-1、15.458 μg·L-1、

14.373 μg·L-1、15.004 μg·L-1和15.385 μg·L-1，称样量为

2.5 g，测定值为30.498 μg·kg-1、32.052 μg·kg-1、30.916 μg·kg-1、28.746 μg·kg-1、30.008 μg·kg-1和

30.770 μg·kg-1，标准偏差为，标准不确定度为，相对标准不确定度为。

其他化合物则参照该方法，样品重复性测量引入的相对标准不确定度结果见表8。

2.2.7 加标回收率引入的相对标准不确定度urel（Rec）

使用加标法对回收率进行检测。加标量为

50 μg·kg-1，标准偏差为，标准不

确定度为，相对标准不确定度为

以阿莫西林为例，加标回收率为（85.93%、83.44%、85.67%、87.98%、82.15%和85.99%，标准偏差为，标准不确定度为，相对标准不确定度为。其他化合物则参照本方法，加标回收率引入的相对标准不确定度结果见表9。

2.2.8 液相色谱－串联质谱仪引入的相对标准不确定度urel（LC）

出具校准证书中液相色谱－串联质谱仪的U=6.8%（k=2），其相对标准不确定度为

2.3 合成不确定度与扩展不确定度

将全部的不确定因素进行整理，计算合成不确定度。以阿莫西林为例

其他化合物则参照本方法，结果见表10。

采用液相色谱-串联质谱法对鱼肉中青霉素类药物残留程度进行检测，标准不确定度u（C）=urel（C）×X，扩展不确定度为U（C）=u（C）×k（k=2），则相关计算结果如表11所示。

3 结论与讨论

在此次分析研究期间，使用液相色谱-串联质谱法对鱼肉里的青霉素类药物残留量进行检测，不确定度的关键来源为标准溶液的配制、标准溶液线性拟合和定容样液，而仪器自身的稳定程度、样品重复性检测、添加内标物的体积、加标回收和样品称量当中所产生的不确定度对青霉素类药物残留检测结果影响较小。数据结果证实，在实验过程中，采用更高纯度的标准物质，确保仪器的工作状态良好，定时对仪器维护及保养，从而达到稳定的再现性，可以减少测定结果的不确定程度，从而提升检测结果的精准度。

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